Um sichere und wirksame Impfstoffe zu gewährleisten, ist es unerlässlich, robuste und zuverlässige Charakterisierungswerkzeuge in der Forschung, Entwicklung, Produktion und Qualitätskontrolle einzusetzen.
Das Lösungspaket von Wyatt analysiert kritische Impfstoff-Attribute, darunter:
- Molare Masse
- Viraler, physikalischer Titer und Nukleinsäuregehalt
- Aggregation
- Thermische und kolloidale Stabilität
Viele dieser Assays können für einen hohen Durchsatz rationalisiert und automatisiert werden.
Unsere Technologien sind auch in der Impfstoffforschung und Prozessentwicklung hilfreich, um die Bindungsaffinität und Stöchiometrie von Antikörper-Antigen-Komplexen, den oligomeren Zustand von Oberflächenglykoproteinen oder die Optimierung von Formulierungsbedingungen zu untersuchen.
Lesen Sie weiter, um zu erfahren, wie Wyatt-Produkte zur Charakterisierung bestimmter Impfstoffklassen eingesetzt werden.
Unser White Paper WP9007: Characterizing Vaccines with Light Scattering steht ebenfalls zum Download bereit.
mRNA/DNA
Impfstoffe, die auf mRNA oder DNA basieren, werden oft über Lipid-Nanopartikel, virusähnliche Partikel oder andere Nanopartikel-Vektoren verabreicht. Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS) und Dynamische Lichtstreuung (DLS) sind nützlich, um die mRNA selbst, den Trägerpartikel und den kompletten Impfstoff zu charakterisieren.
Biophysikalische Eigenschaften von mRNAWie in der Application Note AN1616: SEC-MALS methods for characterizing mRNA beschrieben, werden wichtige biophysikalische Eigenschaften von mRNA durch SEC-MALS plus DLS quantifiziert. Diese Analysen bestimmen das Molekulargewicht, den Anteil der Aggregate, den Gyrationsradius Rg und den hydrodynamischen Radius Rh. Das Verhältnis zwischen molarer Masse und Rg identifiziert einzel- oder doppelsträngige RNA, während das Verhältnis Rg:Rh die molekulare Konformation anzeigt.
Diese Methode kann leicht angepasst werden, um zu untersuchen, wie diese Eigenschaften durch die mRNA-Präparation, die Formulierung und die Lagerungsbedingungen beeinflusst werden.
Charakterisierung von LNP-Transportern
Zu den Lipid-Nanopartikeln (LNPs) gehören Nano-Emulsionen, Mizellen und feste Lipid-Nanopartikel. Einer der wichtigsten Parameter für die Aufnahme in den Lymphknoten, um die Antigen-präsentierenden Zellen zu erreichen, ist die Größe. Nur LNPs mit einem Durchmesser von weniger als etwa 150 nm werden aufgenommen, während größere LNPs an der Injektionsstelle zurückgehalten werden. Dies stellt einen engen Spielraum bezüglich der Größe für die am besten funktionierenden LNPs dar.
FFF-MALS bestimmt hochauflösende Größenverteilungen und quantifiziert die Partikelkonzentration in jeder Größenfraktion, um die Wirksamkeit eines LNP-mRNA-Trägers präzise zu qualifizieren. Wyatt Technology bietet komplette FFF-MALS-Systeme an, die auf dem Eclipse™ FFF-Controller und dem DAWN™ Mehrwinkel-Lichtstreudetektor basieren, mit umfassender Software für die Methodenentwicklung, Gerätesteuerung, Datenerfassung und Analyse. Weitere Details zu den Anwendungen von FFF-MALS in der LNP-Charakterisierung finden Sie in WP2608: Lipid nanoparticle and liposome characterization with FFF-MALS.
LNP-Prozessentwicklung und Analytik
Sobald eine erfolgreiche LNP/mRNA-Plattform entwickelt wurde, wird die Skalierung des Prozesses durch Echtzeit-Mehrwinkellichtstreuung (RT-MALS) unterstützt. Mit einem ultraDAWN™ entweder in-line oder on-line, wird eine kontinuierliche Überwachung von kritischen Qualitätsattributen wie Größe und molarer Masse erreicht. Die Echtzeitüberwachung der Liposomgröße in einer Produktionsumgebung wird in AN8006: In line monitoring of liposome size by RT-MALS beschrieben.
SEC-MALS-DLS bestimmt korrekte Molekulargewichts- und Größenwerte für mRNA, auch wenn die Moleküle ganz anders eluieren als globuläre Proteinstandards wie Thyroglobulin.
Ein komplettes SEC-MALS-System umfasst die HPLC einschließlich UV-Detektor, SEC-Säule(n), MALS- und RI-Detektor. Steuerung, Datenerfassung und Analyse erfolgen über die ASTRA™-Software.
Viren (inaktiviert oder lebend-abgeschwächt)
Diese komplexen Impfstoffprodukte kombinieren mehrere Serotypen, oft mit Adjuvantien. Die asymmetrische Fluss-Feldflussfraktionierung (AF4) trennt solche komplexen Proben mit hoher Auflösung nach Größe. Nach der Fraktionierung folgen mehrere Online-Instrumente, darunter MALS, DLS, UV- und Fluoreszenzdetektoren, um die biophysikalische Charakterisierung zu vervollständigen.
Produkt-ValidierungIn der hier gezeigten Analyse einer Influenzavirus-Subpopulation werden sowohl die Größe als auch die Gesamtpartikelkonzentration mittels FFF-MALS detailliert quantifiziert. Der Vergleich mit den Ergebnissen aus der TEM zeigt eine hervorragende Übereinstimmung innerhalb von 2 % bei der Viruskonzentration und 5 % bei der Größe. Ein kleiner Dimer-Peak wird ebenfalls identifiziert.
Ergänzend zu FFF-MALS bietet der DynaPro™ Plate Reader ein Hochdurchsatz-Screening von Hunderten von Proben in Bezug auf Verarbeitungsbedingungen und Formulierungen. Neben der Größenbestimmung ist diese Technik in der Lage, auf die thermische Stabilität von Virusproben zu screenen und die virale Partikelkonzentration zu bestimmen.
Zusätzliche LiteraturUnter http://doi.org/10.1016/J.JVIROMET.2007.04.008 finden Sie den Vergleich der FFF-MALS-Analyse mit anderen Methoden wie der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), der Rasterkraftmikroskopie (AFM), der Größenausschlusschromatographie kombiniert mit MALS (SEC-MALS), der Echtzeit-quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT q-PCR), der mittleren Gewebekulturdosis (TCID50) und dem Fluoreszenzfokus-Assay (FFA).
FFF-MALS ist ein hervorragendes Werkzeug zur Impfstoffcharakterisierung. Die Gesamtvirenzahl und -größe kann mit hoher Auflösung für jede Subpopulation quantifiziert werden.
Virus-ähnliche Partikel (VLPs)
Rekombinante virusähnliche Partikel, die auf die gleiche Weise wie ein herkömmlicher abgeschwächter Lebendimpfstoff eine Immunreaktion hervorrufen sollen, bestehen typischerweise aus einem Proteinkapsid mit Nukleinsäure-Fracht. SEC-MALS und FFF-MALS charakterisieren sowohl das Kapsid als auch die Ladung, während DLS als Qualitätskontrollinstrument geeignet ist, um Größe, Aggregation und den physikalischen Virustiter zu bestimmen.
Überwachung des Produktionsprozesses: Messung von Proteinkapsid und DNA-FrachtDie Synthese von VLPs umfasst drei Schritte: 1) Isolierung des rekombinanten VLP aus der Zellkultur, 2) Dissoziation des Virus in pentamere Kapsomere mit Entfernung der gesamten DNA, 3) Einbringen der gewünschten DNA und Bildung eines neuen VLP.
FFF-MALS wird verwendet, um diesen Prozess zu überwachen, indem vollständig gebildete Kapside von Aggregaten, nicht zusammengesetzten Protomeren bzw. Kapsomeren getrennt und nachgewiesen werden. Die Analyse informiert über die Konformation und misst im letzten Schritt des Prozesses gleichzeitig die molare Masse von Protein und DNA, um die Beladung zu quantifizieren.
Zusätzliche LiteraturPL2609: FFF-MALS-DLS nanoDDS key publications enthält Verweise auf Publikationen, die den Einsatz von FFF-MALS zur Charakterisierung von Liposomen, Polymersomen, virusähnlichen Partikeln und anderen potenziellen Genvektor-Transportvehikeln hervorheben
Im Webinar VLP Characterization: The Light Scattering Biophysical Toolbox erfahren Sie mehr über zusätzliche Möglichkeiten zur Charakterisierung von VLPs und deren Interaktionen mit neutralisierenden Antikörpern.
Unter http://doi.org/10.1016/j.bej.2015.04.004 erfahren Sie mehr über eine schnelle und einfache Screening-Methode, die auf Dynamischer Lichtstreuung im Hochdurchsatz mit dem DynaPro Plate Reader basiert und zur Identifizierung von Bedingungen für eine verbesserte Stabilität von modularen Impfstoffkandidaten, die aus Kapsomeren bestehen, eingesetzt wird.
Die ASTRA-Software bestimmt gleichzeitig die Molmassenverteilung für VLP und Protein, um die DNA-Beladung zu quantifizieren.
Der DynaPro Plate Reader ermöglicht ein schnelles Screening von Formulierungen auf Größe und Stabilität.
Polysaccharid- und Glykokonjugat-Impfstoffe
Polysaccharid- und Proteinglykokonjugat-Impfstoffe kombinieren Adjuvantien mit hochmolekularen Polysaccharid-Antigenen, die typischerweise mehrere Serotypen umfassen. Bei Proteinglykokonjugaten sind die Proteinadjuvantien direkt mit dem Polysaccharid kovalent verbunden.
Da das Molekulargewicht für die Immunogenität dieser Art von Impfstoffen von zentraler Bedeutung ist, sind SEC-MALS und FFF-MALS für deren Charakterisierung und Qualitätskontrolle unerlässlich.
Charakterisierung von Größe und molarer MasseFFF-MALS, eine Kombination aus Eclipse FFF-Controller, DAWN MALS-Detektor,
Optilab™-dRI-Detektor und HPLC-Komponenten nach Industriestandard, ist das bevorzugte Mittel zur Charakterisierung von Protein-Polysaccharid-Konjugat-Impfstoffen, deren MW über zehn oder hundert MDa liegt. Da es keine Säulenmatrix gibt, findet keine scherungsinduzierter Degradation statt, während über den gesamten Größenbereich fraktioniert wird. MALS bestimmt molare Masse und Größe gleichzeitig.
Für kleinere Moleküle kann SEC-MALS leichter eingesetzt werden. Typischerweise kann SEC-MALS nicht nur die gesamte molare Masse des Moleküls bestimmen, sondern auch den Gehalt an Protein und den Gehalt an Polysaccharid in jeder Elutionsfraktion quantifizieren. Ein SEC-MALS-System umfasst eine HPLC-Pumpe, einen Autosampler und eine Säule, ein DAWN und ein Optilab und kann auch ein ViscoStar™-Differenzialviskosimeter für die zusätzliche Analyse der Konformation enthalten.
Weitere Details zur Analyse von Protein-Polysaccharid-Konjugat-Impfstoffen und anderen Impfstofftypen erhalten Sie in unserem Webinar Vaccines, Well Characterized? Light scattering solutions for biophysical characterization in vaccine R&D.
AN8005: RT-MALS end-point determination of a polysaccharide depolymerization process beschreibt, wie der ultraDAWN Echtzeit-MALS-Detektor das Molekulargewicht von Polysacchariden während der Verarbeitung überwacht, um eine optimale Qualität in der Produktion sicherzustellen.
AN1306: Polyvalent pneumococcal polysaccharide vaccine characterized by SEC-MALS beschreibt, wie MALS zur Unterstützung der Qualitätskontrolle in der Impfstoff-QC eingesetzt werden kann.
FFF-MALS charakterisiert präzise Molmassen- und Größenverteilungen für große Protein-Polysaccharid-Konjugate.
Der DAWN MALS-Detektor quantifiziert Molmassen bis zu Hunderten von MDa.