Real-Time MALS

RT-MALS（实时多角度光散射）是一种将多角度光散射仪和实时软件应用于处理设备的强大技术，例如制备色谱、切向流过滤、均质器、反应器或纳米粒子生产系统。可用于监测大分子、纳米粒子和小型基因载体（如AAV）的属性，包括：

• 摩尔质量
• 尺寸
• 粒子浓度或滴度
• 空心：实心比例

该技术通过持续采样来进行。在较低的流速下，整个过程可以通过 ultraDAWN 的流动池，被激光束探测，而对于较高的流速或静态容器（如反应器），一小部分产品会被连续抽出并输送至 ultraDAWN 可选稀释度高达 10 倍。

MALS信号与某些应用程序的外部紫外吸收信号一起被分析，以量化分析物的物理特性。可以进行高达每秒5次的测量，以实现快速反馈和过程控制。

衡量产品，而不是过程

传统的过程分析技术（PAT）监测过程参数，如时间、浓度、温度、pH值和原料。RT-MALS在纳米粒子、生物制药品、基因载体和聚合物生产中代表了一项过程分析技术的突破：关键质量属性（CQAs）可以直接或在线监测，用于快速反馈产品属性和过程质量。

RT-MALS 适用于多糖抗原、单克隆抗体、治疗性蛋白、载药脂质体、病毒载体或 RNA 封装脂质纳米颗粒等先进产品。它可以量化尺寸、分子量和粒子浓度，并在值达到或偏离指定范围时生成过程触发信号。与OBSERVER RT-MALS软件结合使用，ultraDAWN在车间进行主要CQA的测量，以提高产量和质量。

RT-MALS --绝对测量

对于大多数单元操作，RT-MALS 提供独立于产品特定校准曲线的第一原理测量。

• 使用基本物理方程将摩尔质量与散射光强度（由MALS测量）和浓度（由UV或dRI测量）结合起来。
• 用于根据散射强度和角度依赖性计算粒子大小和浓度的方程。
• 通过光散射加上260 nm和280 nm处的UV吸收计算AAV等小型病毒载体的基因载荷。
• 分析不依赖于分子形状/构象或流速，并且不受多重散射的影响。

RT-MALS可以确定1000 g/mol到10E+9 g/mol的分子量。它还可以确定10 nm到250 nm的分子或纳米粒子半径。且MALS检测器每年只需要校准一次。

聚集体和杂质

聚集体和类似的产品相关杂质以及过程相关杂质（例如基因载体附带的游离 DNA）的存在可以通过相对于所需产品的摩尔质量或大小差异来推断。

RT-MALS 主要适用于监控生物制品的下游加工（DSP），以及合成纳米颗粒如 LNPs 的生产。

从事 DSP 工作的生物工艺发展科学家通常需要等待几天甚至几周，才能将分离出的部分或样品送到分析实验室进行分析，以了解新工艺或对现有工艺进行修改。利用 RT-MALS，他们能够立即获得有关工艺参数影响的信息，从而缩短开发周期，减少新产品上市时间。

与此同时，使用 RT-MALS 的用户可以获得宝贵的工艺知识，直接与工厂化工程师进行联系。

使用 RT-MALS 的生物工艺工程师可以确保每个工艺步骤中的产品都符合规格要求，而不受工艺参数的微小变化影响。他们将从通过 RT-MALS 获得的早期工艺开发的工艺知识中受益。

PAT（过程分析技术）的倡导者立即意识到了 RT-MALS 赋予的 QbD（质量按设计）优势：直接测量相关产品属性，实时地、在线或联机的与单元操作进行关联，从而确保可靠的工厂化生产。

MALS（多角度激光检测器）检测器包含 18 个相对于激光束以不同角度 θ 定位的光电二极管，用于测量散射光函数 R(θ)，以及一个用于测量流动池中透射光的光电二极管。在每个数据点上，通常每秒测量两次或更多次：

1. 散射强度 vs. 角度的图形 R(θ) 被拟合以确定 R(0)（在角度 θ = 0 时的 y-截距）。
2. 对于大分子：
• 从 R(0) 和浓度的比率计算出重均摩尔质量M_w 。浓度可以从 UV/Vis 导出，通过模拟输出传递给 ultraDAWN，或者当浓度在过程中已知且恒定时，由用户输入到 OBSERVER 中。
• 通过将适当的方程拟合到 R(θ) 的角度依赖性，计算出 Z-平均旋转半径R_g 。
3. 对于包囊较大基因载体的纳米颗粒：
• 根据 R(θ) 的角度依赖性计算出 Z-平均半径 R 。
• 根据 R(0) 和颗粒半径计算出颗粒浓度（例如每毫升病毒颗粒）。
4. 对于 AAV 和其他小型病毒载体：
• 将 R(0) 与 UV 在 260 和 280 nm 波长处的吸光度结合起来，确定蛋白质壳和核酸基因组的摩尔质量。
• 分析摩尔质量以确定实心：总衣壳比 Vg/Cp。结合紫外吸光度和摩尔质量来计算总衣壳滴度、实心衣壳滴度和空衣壳滴度。
• 根据 R(θ) 的角度依赖性计算出 rms 半径 R g 。

大多数用于确定M_w、半径、颗粒浓度、Vg/Cp 等的常数与系统的光学性质有关，如激光波长和溶剂（流动相）的折射率。此外，必须知道或测量分析物在流动相中的折射率（对于颗粒）或 dn/dc 值，流动相中大分子的特定折射率增量（对于大分子），以及使用 UV 检测器时必须提供消光系数。有关 MALS 理论的更多细节，请参阅我们的MALS 理论页面。

RT-MALS 的局限

RT-MALS 只能确定平均摩尔质量、粒子尺寸、粒子浓度和 Vg/Cp。颗粒尺寸分布以及浓度可以通过在线使用 DynaPro^® NanoStar^® 或 DynaPro Plate Reader 动态光散射仪进行测量。另一种在线方法是将 UHPLC 的 microDAWN^® MALS 探测器与取样前端和 UHP-SEC 分离结合，每 3-5 分钟提供详细的定量分析。

与FPLC联机

如要在 FPLC 中使用 RT-MALS，需要标准的制备型 FPLC 系统，配备具有模拟输入/输出和数字信号的 I/O 盒；ultraDAWN；以及 OBSERVER（用于实时分析并反馈到 FPLC）或 ASTRA 软件（用于后期分析）。通常，这种组合对高达 150 mL/min 的流量都能正常运行。

当监测蛋白质、核酸或 AAV 时，FPLC UV 检测器的信号通过网线传送到 ultraDAWN。对于蛋白质或核酸的测量，需要一个 UV 波长，而对于 AAV，则需要两个（260 nm 和 280 nm）。在监测较大的病毒载体时，不需要 UV，但可以将信号导入 OBSERVER 或 ASTRA 进行比较。

FPLC 软件与 OBSERVER 或 ASTRA 之间的数据收集通过交换数字同步进行。此外，OBSERVER 可以向 FPLC 输出两种类型的模拟信号：

1. 触发器：A +2 V 的“触发器”信号，用于指示洗脱物是否符合混合条件；
2. 数据：与测量属性（如摩尔质量或 Vg/Cp）成正比的模拟电压，可以导入 FPLC 软件，显示并存储原始数据。

与其他系统联机

ultraDAWN 可以与提供相对低流量的其他系统联机，例如 TFF 或微流体纳米颗粒生产设备。联机操作的限制通常是工艺设备的背压：ultraDAWN 在 150 mL/min 时产生 0.7 bar（9 psi）的背压，因此如果工艺可以承受更高的背压，则可以实现更高的流量。

大多数流速相对较低的系统不具备 FPLC 提供的全功能控制软件，TFF 可能除外。数据收集等通常通过 OBSERVER 或 ASTRA 手动控制。但是，如果用户提供适当的模拟信号，则可以执行与 FPLC 类似的集成。

在色谱中联机

对于工业化的色谱，流速通常太高而无法通过 ultraDAWN，因此采用了在线配置。由 OBSERVER 控制的四元 HPLC 泵从主流程中连续抽取一小部分样本，流速为 0.1 - 10 mL/min。

泵可以选择性地配置为对样品进行连续稀释。 稀释对于以下特定条件很重要：

• 当流动相的离子强度较低时，用中等或高离子强度缓冲液稀释样品，以便屏蔽分子之间的静电相互作用；
• 当流动相的离子强度变化较大且浓度较高（> 2 mg/mL）时，使用中等离子强度缓冲液以较高的稀释比稀释样品，以实现几乎恒定的、良好缓冲的条件；
• 当样品浑浊度极高时，进行稀释以实现光传输。

在联机配置中，OBSERVER 可以与 FPLC 交换模拟信号，如在线 FPLC 设置部分所述，但不能交换数字信号以同步数据收集 - 这必须手动完成。

与其他工艺设备联机

使用四元 HPLC 泵，ultraDAWN 也可以连接到高流速的 TFF 或灌装设备，以及类似化学反应器的静态容器。通常，这些设备不提供模拟数字接口，但如果可用，则 ultraDAWN 可以连接它们。如果需要 UV 测量，可以在泵和 ultraDAWN 之间放置一个独立的 UV 检测器进行测量。

GMP流程

软件：

• 数据处理分析遵循 21 CFR Part 11 标准的规定，ASTRA 可以提供 ASTRA Security Pack，以确保合规性。
• 实时分析方面，OBSERVER 可以提供 OPC-UA 连接功能。用户可以编写 OPC-UA 客户端来满足合规要求，如安全数据库或审计跟踪。当连接到 OPC-UA 客户端时，OBSERVER 用户界面会被锁定，防止用户干预。

硬件方面：

• 目前 ultraDAWN 不适用于对流通池进行喷雾灭菌或伽马射线照射/高压灭菌。
• 流通路径可以使用1 M NaOH或大多数其他标准灭菌溶液进行内部清洁，并且清洁过程会与整个设备进行验证。
• 仪器可以放置在适用于喷淋灭菌的柜子中。

为了在离子交换色谱纯化过程中收集富含病毒的组分，RT-MALS 会监测颗粒半径 R。当 R 处于区分单体病毒颗粒和较小蛋白质的合适范围内时，触发器被设置为打开并激活收集阀 、DNA、病毒聚集体或细胞裂解物片段。 同时，它计算病毒颗粒浓度，以便立即测定池中的滴度。

了解如何将 MALS 用于快速在线监测病毒样颗粒纯化，请参阅Aguilar et al., “At-line multi-angle light scattering detector for faster process development in enveloped virus-like particle purification”, J. Sep. Sci. (2019)

超滤

通过设置 ultraDAWN 来监测颗粒浓度，可以控制用于浓缩病毒载体的切向流过滤步骤。通过泵将 ultraDAWN 连接到 TFF 流动路径，在线配置中持续接收样品（随后返回到 TFF 系统）。在 OBSERVER 中，触发器被编程设置，当浓度超过指定的终点时，向控制系统发送信号以终止该过程。

同时，监测病毒大小以立即识别潜在的颗粒降解。

查看 最近关于使用 RT-MALS 监测下游病毒载体生产过程的网络会议。

多糖解聚

在这个过程中，多糖的水解必须在其达到目标分子量 350 kDa 时被停止。使用在线配置，样品从反应器中连续提取，并与缓冲液稀释，然后输送到 ultraDAWN。RT-MALS 监测分子量，并在分子量低于指定的终点时停止。

下载应用说明 AN8005：多糖解聚过程的 RT-MALS 终点测定。。 Rajendar 等人还证明了 MALS 与制备型尺寸排阻色谱法一致，可用于实时监测蛋白质-多糖缀合物的纯化，Rajendar et al., “Multi angle light scattering as a process analytical technology tool for real-time monitoring of molar mass of protein-polysaccharide conjugate fractions”, J. Chromat. Open (2022)。

蛋白质纯化

通过 RT-MALS 测定的重均分子量可用于使用带有流通式疏水相互作用色谱的 ultraDAWN 串联式来估计精制步骤中的聚集体含量。在这个示例中，使用了一个重均分子量为 146.8 kDa 的单克隆抗体（mAb），OBSERVER 的触发器被设置在 145 到 152.5 kDa 之间。触发器在 31 分钟时打开，91 分钟时关闭，检测池中的总聚集物含量为 0.9%。

了解 Patel 等人如何首次证明 RT-MALS 在流通式 mAb 纯化过程中提供高度准确的聚集体负载监测， “Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control”, mAbs 2018。

在应用笔记 AN8004 中有一个示例，介绍了利用 bind-and-elute 离子交换色谱纯化的单克隆抗体 Fab 臂的联线 MALS 监测和优化汇集的情况，用于结构生物学应用。AN8004: Coupling MAS with preparative ion-exchange (pIEX) for structural biology applications。

AAV 富集

离子交换色谱（IEX）是分离空心和实心腺相关病毒载体以及去除残留杂质的常见方法。在制备规模的 IEX 系统中实施 RT-MALS 可以监测每个洗脱分数的壳粒子和病毒基因浓度，并在 Vg/Cp 超过指定值时发出信号以控制聚集。同时，ultraDAWN 和 OBSERVER 提供了其他关键产品属性，这些属性可能与 AAV 和游离 DNA 等过程杂质之间的聚集和区分相关。

Wagner et al., “Biophysical Characterization of Adeno-Associated Virus Vectors Using Ion-Exchange Chromatography Coupled to Light Scattering Detectors”, Intl. J. Mol. Sci (2022) 中介绍了与 IEX 联机的 MALS 的使用，用于对 AAVs 进行全面表征：空壳粒子滴度、满载比率、空壳粒子和核酸的绝对摩尔质量、大小和多分散性。这些关键质量属性和其他属性现在可以在制备规模的 IEX 中通过 ultraDAWN 和 OBSERVER 进行实时确定。

脂质体均质化

脂质体开始时具有广泛的尺寸范围，但通过均质化过程，将其减小为统一的尺寸，并呈现出较窄的尺寸带。RT-MALS 监测产品属性，如半径和浓度；如果它们超出指定范围，OBSERVER 将向过程控制系统发出信号，将不合格产品转移到废物中，以避免污染收集容器。

下载应用笔记 AN8006: In-line monitoring of liposome size by RT-MALS。

In order to collect virus-enriched fractions during ion-exchange chromatographic purification, RT-MALS monitors particle radius R. The trigger is set to turn on and activate a collection valve when R is within a suitable range for differentiating monomeric virus particles from smaller proteins, DNA, virus aggregates or cell lysate fragments. At the same time, it calculates viral particle concentration for immediate determination of titer in the pool.

Learn how MALS is used in rapid at-line monitoring of virus-like particle purification in Aguilar et al., “At-line multi-angle light scattering detector for faster process development in enveloped virus-like particle purification”, J. Sep. Sci. (2019)

Ultrafiltration

A tangential flow filtration step for concentrating viral vectors can be controlled by an ultraDAWN set up to monitor particle concentration. The ultraDAWN is connected to the TFF flow path in an on-line configuration by a pump and continuously receives sample (which is subsequently returned to the TFF system). In OBSERVER, the trigger is programmed to turn on when the concentration is above the specified end point, signaling to the control system to terminate the process.

Simultaneously, the viral size is monitored to immediately identify potential particle degradation.

View recent webinars on the use of RT-MALS for monitoring downstream viral vector production processes.

Polysaccharide depolymerization

In this process, hydrolysis of the polysaccharide must be quenched when it reaches the target molecular weight of 350 kDa. Using the on-line configuration, sample is continuously drawn from the reactor, diluted with buffer and delivered to the ultraDAWN. RT-MALS monitors molecular weight and sets the trigger when MW is below the specified end point.

Download the application note AN8005: RT-MALS end-point determination of a polysaccharide depolymerization process. MALS has also been demonstrated in-line with preparative size-exclusion chromatography for real-time monitoring of protein-polysaccharide conjugate purification in Rajendar et al., “Multi angle light scattering as a process analytical technology tool for real-time monitoring of molar mass of protein-polysaccharide conjugate fractions”, J. Chromat. Open (2022).

Protein purification

The weight-average molecular weight determined by RT-MALS can be used to estimate aggregate content in a polishing step using an ultraDAWN in-line with flow-through hydrophobic interaction chromatography. In this example with a 146.8 kDa mAb, OBSERVER’s trigger is programmed for a band between 145 and 152.5 kDa, the latter corresponding to 3.5% aggregate. The trigger turns on at 31 minutes and off at 91 minutes for overall aggregate content in the pool of 0.9%.

Read how RT-MALS was first demonstrated to provide highly accurate monitoring of aggregate load during flow-through mAb purification in Patel et al., “Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control”, mAbs 2018.

An example of in-line MALS for monitoring and optimizing the pooling of a monoclonal antibody Fab arm purified by bind-and-elute ion-exchange chromatography appears in AN8004: Coupling MALS with preparative ion-exchange (pIEX) for structural biology applications.

AAV enrichment

Ion-exchange chromatography (IEX) is a common method for separating empty and full adeno-associated viral vectors as well as removing residual impurities. RT-MALS may be implemented in prep-scale IEX systems in order to monitor the capsid particle and viral genome concentrations of every eluting fraction, and signal when Vg/Cp is above a specified value in order to control pooling. At the same time ultraDAWN and OBSERVER provide other key product attributes that can be related to aggregation and discrimination between AAVs and process impurities like free DNA.

Learn how RT-MALS is used to accelerate the development of a process for AAV enrichment by ion-exchange chromatography in our application note AN8008: Real-time monitoring and control of AAV chromatographic enrichment with RT-MALS.

Liposome homogenization

Incoming liposomes begin with a wide size range but are reduced to a uniform size via homogenization, emerging within a narrow size band. RT-MALS monitors product attributes such as radius and concentration; if they fall outside the specified range, OBSERVER signals the process control system to divert out-of-spec product to waste in order to avoid contaminating the collection vessel.

Download the application note AN8006: In-line monitoring of liposome size by RT-MALS.

ultraDAWN

ultraDAWN - 唯一用于过程和实时操作的 MALS 探测器。它包含 18 个角度的探测器，可检测 200 Da 到 1 GDa 的摩尔质量和从 10 到 250 nm 的半径，以及一个传输探测器，可在浑浊条件下获取准确的浊度。

• 标准型：室温；适用流速从 0.1 到 150 mL/min，需更换管道
• 高温/制冷型：-15° C 到 +150 °C；适用流速从 0.1 到 5 mL/min

两个版本的 ultraDAWN 都可以配置光学衰减器，以测量浑浊溶液。了解更多信息。了解更多。

OBSERVER 用于过程分析和过程控制的实时多角度光散射（MALS）测量。

• 软件可以接受 MALS 数据和紫外线模拟数据（由 ultraDAWN 数字化）以量化大分子、纳米颗粒和 AAVs 或其他用于基因或药物递送的亚 50 nm 载体的产品属性。
• 联机：通过模拟和数字信号交换与 FPLC 和类似系统集成。将模拟触发信号和模拟数据输出到 FPLC 系统。
• 在线：控制四元 HPLC 泵以连续取样。向过程控制输出模拟触发信号。
• 大分子：确定摩尔质量和 rms 半径。可通过摩尔质量的变化估算聚集水平。
• 纳米颗粒：确定平均颗粒大小和浓度。通过大小将颗粒与游离大分子区分开。
• AAVs（和其他小载体）：确定 Vg/Cp、总和实心浓度、空壳粒子和有效负载摩尔质量、rms 半径。通过空壳粒子摩尔质量的变化估算聚集水平。
• OPC-UA 连接用于商业流程和 GMP 运营。

ASTRA - 对在MALS 测量中进行的综合的后处理分析，以确定摩尔质量、大小、颗粒浓度等。还分析在线 DLS 数据。

• The Security Pack 附加组件支持 21CFR(11) 遵从性，包括完整的审计跟踪和电子签名。

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