Wyatt Technology

Verbessern Sie Ihre Proteinanalytik durch den Einsatz von Streulichtdetektoren

Language: German

November 11, 2016

Sprecher: Dr. Felix Deluweit, Application Scientist Wyatt Technology Europe

Die Größenausschlusschromatographie (engl. Size Exclusion Chromatography, SEC) stellt
eine weit verbreitete Technik zur Trennung von Proteinen, Polymeren und Biopolymeren dar.
Sie wird häufig mithilfe der konventionellen Säulenkalibrierung auch zur Bestimmung von
Molekulargewichten (Mw) eingesetzt. Diese Methode basiert jedoch auf der Verwendung von
Standards. Da die SEC aber nach hydrodynamischem Volumen trennt und damit eben nicht
exakt nach Molekulargewicht, führen Unterschiede zwischen Probe und Standard – etwa in
der Konformation – schnell zu erheblichen Abweichungen der erzielten Ergebnisse von den
tatsächlichen Werten.
Im Gegensatz dazu ermöglicht die Mehrwinkellichtstreuung (engl. Multi-Angle Light
Scattering, MALS) die Bestimmung der absoluten Molmassen ohne den Einsatz von
Standards. Grundlage des Verfahrens ist die Messung der Intensität des von den Molekülen
bzw. Partikeln gestreuten Lichts.

Neben der statischen Lichtstreuung (SLS), wie sie bei MALS Anwendung findet, ist die
dynamische Lichtstreuung (DLS) eine schnelle Methode zur Qualifizierung verschiedener
Pufferbedingungen und zur Identifizierung von Aggregaten. Über ihren Einsatz in
Formulierungsstudien hinaus stellt die dynamische Lichtstreuung überdies eine sensitive und
zuverlässige Technik dar, um die Stabilität von Proteinen zu untersuchen. Sie bietet damit
eine Alternative zu Farbstoff - basierten Methoden. Während die DLS eher als Batch-Technik
(Küvette oder Mikrotiterplatte) Verwendung findet, wird MALS in der Regel mit
leistungsfähigen Trennmethoden wie der SEC oder der Asymmetrischen Fluss Feld-Fluss-
Fraktionierung (AF4) kombiniert. Mit einer solchen Kopplung lassen sich
Molmassenverteilungen von Biomolekülen in Lösung standardfrei untersuchen.

Für die Berechnung der Molekulargewichte mithilfe von MALS benötigt man zusätzlich die
Daten aus einem Konzentrationsdetektor (UV- oder RI-Messung). Setzt man beide Verfahren
zur Bestimmung der Konzentration ein, so lassen sich auch Copolymer- bzw. Protein-
Konjugat - Analysen durchführen. Auf diese Weise kann man zum Beispiel für einen
Komplex aus Antikörper und Wirkstoff (ADC: antibody drug complex) das numerische
Verhältnis zwischen einem Antikörpermolekül und daran gekoppelten Wirkstoffmolekülen,
die so genannte DAR (drug-to-antibody ratio), ermitteln. Diese ist ein wertvoller Indikator zur
Beurteilung der Kopplungseffektivität bei der Herstellung solcher Therapeutika.

 

 

   

For essential macromolecular and nanoparticle characterization—The Solution is Light™

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Wyatt Technology is the recognized leader in light scattering instrumentation and software for determining the absolute molar mass, size, charge and interactions of macromolecules and nanoparticles in solution.

Wyatt's line of multi-angle static light scattering products couple to size exclusion chromatography (SEC-MALS), field-flow fractionation (FFF-MALS), and stop-flow composition-gradient systems (CG-MALS). Our dynamic light scattering (DLS) products operate in traditional cuvette as well as on-line and automated, high-throughput modes. We also offer unique instruments for electrophoretic light scattering (MP-PALS), differential refractometry, and differential viscosity.



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