采用高通量的方式检测样品的大小、稳定性和数量
动态光散射技术（DLS）能够快速、低体积、无损地测量多种运载工具，包括腺相关病毒（AAV）、慢病毒和脂质纳米粒。DynaPro® Plate Reader是直接在微孔板中进行的采用高通量方式测定产品质量、稳定性和数量的首选工具。 DynaPro® NanoStar®能够在体积低至2µL的石英试管中进行相同的测量。《WP5003：微型孔板中的自动动态和静态光散射，可快速高效地开发生物制剂》突出了DLS在许多生物治疗中的关键功能。
病毒载体的定量测量
使用DynaPro Plate Reader或NanoStar可以在几秒钟内直接测量总病毒体浓度。动态光散射（DLS）与静态光散射（SLS）相结合在相同强度下测量流体力学半径，以确定准确的颗粒浓度。该技术适用于小型病毒载体，如AAV，以及半径大于100nm的大型病毒和脂质纳米粒。
对三个AAV样品，S1，S2和S3的DLS测量表明其中一个样品（S3）含有一小部分半径大于100nm的大聚集体。即使它的浓度只是粒子总数的一小部分，这种聚集粒子群依旧被检测和量化。DynaPro仪器中的颗粒浓度与其他定量技术（包括SEC-MALS）一致（详情见下文）。重要的是，使用DLS的单机表征能够检测和定量在色谱条件下可能被移除或破坏的较大物种。
有关详细信息，请参阅应用说明《AN5007:DynaPro DLS/SLS仪器对基于AAV的病毒载体的特性鉴定》。
非病毒载体定量
对于非病毒载体，如包裹核酸的脂质纳米粒，也可以进行类似的测量。更多信息，请参见脂质纳米颗粒表征解决方案.
三种AAV样品的DLS分析，表明了样品的大小和浓度。 S3含有大量聚集体。
配方筛选
在开发的早期阶段筛选基因疗法制剂的能力确保只有最合适的候选药物才能通过开发流程。 使用DLS测量大小和大小分布可快速评估聚集程度和样品的稳定性。
借助DYNAMICS®软件提供的分析和可视化工具套件，可以轻松确定多个质量属性，以开发出最稳定，最可靠的产品。 这些分析包括以下内容：
- 产品和聚合物的筛分尺寸和粒度分布
- 确定促进组装良好的产品的SEC流动相或配方缓冲液
- 测量胶体稳定性和聚集倾向
- 通过聚集温度或聚集时间确定构象稳定性
在《病毒和非病毒载体CQAs的量化》网络研讨会上了解更多关于应用Wyatt的DLS工具进行生物制品高通量筛选的信息。
在多孔板中筛选生物制剂的过程可快速发现聚集（顶部）和聚集起始温度（底部）。
AAV的质量和数量，遗传有效载荷和相关蛋白
尺寸排阻色谱（SEC）结合多角度光散射（MALS）是分离，表征和定量各种基因治疗载体，其遗传有效载荷以及与基因治疗发展相关的其他蛋白质的理想选择。该方法使用DAWN® MALS 检测器结合Optilab®差分折射率（dRI）检测器和HPLC UV模块，用于测量蛋白质、核酸和生物纳米颗粒。
各种各样的怀雅特色谱柱可用于小蛋白质和核酸的完整表征。柱的大小范围从小于几千Da一直持续到小病毒（通常直径为50纳米）的测量。有关更多信息，请下载我们的配件和服务指南。
完整的SEC-MALS系统包括Wyatt的DAWN MALS检测器、Optilab dRI检测器和大多数行业标准的HPLC泵、自动采样器和UV检测器。
摩尔质量和粒径分布
用SEC-MALS测量摩尔质量和大小的方法并不局限于蛋白质。短寡核苷酸、多糖、全质粒和小生物纳米粒都可以用SEC-MALS进行充分表征。这项技术提供了关于样品均匀性、共轭程度和聚集性的宝贵信息。
这里我们展示了两个质粒的测量摩尔质量，一个是12kbp，另一个是6kbp。峰上摩尔质量分布均匀，符合预期的序列结果。峰前缘均方根半径的增加可能暗示有少量的聚集体，或者可能提示具有相同摩尔质量但半径较大的切口或线性构象的共洗脱。
表征范围仅受SEC柱的范围限制。用FFF-MALS可以很容易地实现对较大病毒和纳米颗粒的MALS测量（见下文）。了解有关SEC-MALS的更多信息，请参阅《WP1615：SEC-MALS用于绝对生物物理表征》。
6 kbp和12kbp质粒的SEC-MALS分析确定了其摩尔质量和半径。在恒摩尔质量（蓝色）下增大尺寸可能表示聚集体或具有拉长构象的单体。
AAV关键质量属性
为了确保使用腺相关病毒作为传递载体进行安全有效的基因治疗，产品必须符合一系列质量属性，包括浓度和含量。
与剂量直接相关的总颗粒浓度至关重要。 SEC-MALS特别适合于测量这些小型病毒载体的总颗粒浓度。结果在所有血清型中都是可靠的，无需复杂的引物或复杂的样品制备。对于有衣壳的内容物，SEC-MALS分析可确定完整病毒和空病毒粒子的数量。
ASTRA® 软件中的病毒载体分析方法可直接测量总颗粒（衣壳）浓度和衣壳含量。与其他技术相比，SEC-MALS结果更具优势，可用于验证PCR或ELISA检测。除了完整和空的衣壳部分，SEC-MALS还确定了蛋白质和核酸部分的摩尔质量。结合ASTRA的21CFR11合规性选择，SEC-MALS很容易定位于基因治疗产品的批次间比较或释放分析。
在应用文献《AN1617：通过SEC-UV-MALS-dRI量化AAV基因治疗载体的质量属性》中了解有关这些测量的更多详细信息。
AAV CQA的SEC-MALS分析同时提供了衣壳和核酸的摩尔质量（上），总衣壳浓度和完整衣壳的分数（下），两者均覆盖在光散射色谱图上。
聚集体，大型病毒和mRNA
尽管SEC-MALS可以测量各种尺寸的质量属性，但该技术在较大颗粒和聚集体方面受到限制。这是因为SEC柱可能会去除或剪切这些物质，导致不完整的表征和定量。
带Eclipse®FFF系统的场流分馏（FFF）在透明的流道中提供温和的分离，且无固定相。这消除了样品降解或被分离矩阵除去的可能性。FFF与MALS相结合可为直径达1µm的生物纳米颗粒提供精确的尺寸、摩尔质量和颗粒浓度。如脂质纳米颗粒表征中所述，FFF-MALS还可以表征非病毒载体的包封效率和有效载荷。
下载我们的出版物，以查找如何将FFF-MALS应用于表征纳米药物。
场流分离在一个开放通道中根据流体动力学半径分离颗粒。
各种粒径的表征
慢病毒、脂质纳米粒和mRNA通常太大，无法从SEC柱中洗脱。在这种情况下，FFF-MALS是理想的分离和表征工具。
当用SEC-MALS分析时，多分散自扩增RNA（saRNA）的平均摩尔质量（Mw）为 2 × 106 g/mol. 而，FFF-MALS显示了该物质的更大的尺寸分布。实际上，真实的Mw比这个数值高出一个数量级，由SEC-MALS所见物质的分子量比例不到整个样品的20％。
ASTRA的数字密度法可直接测量由光散射强度得出的粒径和浓度。这些计算可以应用于各种常见的基因传递载体，包括病毒，病毒样颗粒和脂质纳米颗粒。在CDC的科学家们发表的这篇论文中，了解有关这种方法的灵敏度和线性的更多信息：使用场流分离和多角度光散射对甲型流感病毒颗粒进行定量测量。
测量自扩增RNA（saRNA）的摩尔质量值，覆盖在FFF-MALS图谱上。
分析峰上每个洗脱部分的粒子浓度和半径，显示了由FFF分离的病毒。
聚合物的正交量化
虽然像AAV这样的小型病毒具有SEC-MALS的特征，但大的聚集物被色谱柱过滤掉的可能性仍然存在。FFF-MALS是一种理想的分离和定量分析聚集体并提供正交表征的技术。
在这张FFF-MALS色谱图中，聚集体与单体和二聚体AAV明显分离，并在约25分钟的保留时间洗脱。用FFF-MALS测量的峰的大小范围跨度在〜20 nm至〜100 nm的半径范围内，并且该峰包含1.89 × 1014颗粒（通过ASTRA的数字密度法测量）。但是，使用SEC测量时其中绝大部分颗粒被截流。
在我们的应用说明《AN2003：通过FFF-MALS量化AAV聚集和质量属性》中了解更多关于AAV聚集的FFF-MALS分析。
对AAV单体，二聚体和聚集体的FFF-MALS分析，通过半径进行区分。 较大的聚集体被SEC过滤掉，因此无法通过SEC-MALS进行量化。
AAV培训和方法转移服务
敏感的仪器和强大的软件解决方案是描述基因治疗关键属性的关键，但它们并不是全部。在整个产品开发周期中，需要充分利用这些工具和方法。
怀雅特技术公司现在提供一个特殊的AAV培训和方法转移服务，帮助您建立和运行SEC-MALS病毒载体分析方法。作为此项服务的一部分，应用程序专家将在现场提供一键式SEC方法和标准操作程序，以确保您从一开始就获得成功。
AAV培训和方法转移可与现场PM或IQ/OQ相结合，以确保您在最短的停机时间内启动和运行。
