共轭和有效载荷分析

许多有趣且有用的大分子或纳米粒子由两种化学和物理上不同的物种组成，它们共价、共轭或一个包裹另一个。 这使得很难描述它们的基本特性。

使用 DAWN^® MALS 仪器结合紫外吸收、Optilab^® 示差 (dRI) 检测器和分离技术的多角度光散射 (MALS) 在在分析共轭比或有效载荷，以及尺寸分布、封装效率、形状、构象或聚合物支化方面非常重要。 确定样品中每个成分的数量以及它们的尺寸对于药品、疫苗和基因疗法也尤其重要。

传统的分析尺寸排阻色谱 (SEC) 不足以表征偶联物，因为不存在用于表示其洗脱行为的校准标准品。 MALS、UV 和 dRI 检测器与 SEC 相结合，加上 ASTRA 的共轭分析算法，为大分子的表征提供了解决方案，例如：

• 糖蛋白，脂蛋白和纳米颗粒
• 蛋白质多糖疫苗
• 嵌段共聚物
• 聚乙二醇化蛋白质
• 蛋白质-核酸复合物
• 溶解在胶束中的膜蛋白

原理

从理论上讲，通过结合来自两个不同测量的信息来分析由蛋白质（包含 UV 发色团）和改性剂（例如聚乙二醇或 PEG）组成的复合物。紫外吸收决定蛋白质浓度，而 dRI 决定总大分子浓度。这两个测量足以确定复合物中蛋白质和改性剂的比例（即使两种成分都吸收紫外线，只要它们的吸光度差异很大，这可以进行测量）。

然而，该方法无法确定该物种的总质量或寡聚状态。 MALS 的加入为完整的共轭表征提供了答案。由于光散射与摩尔质量和浓度的乘积成正比，因此这三个信号的组合足以确定每种成分的比率和实际摩尔质量，从而确定低聚状态。该信息对于评估糖蛋白的聚集、确定共轭多糖的分子构象、测量嵌段共聚物的摩尔质量或检测膜蛋白是否作为天然低聚物存在至关重要。

腺相关病毒和小的无包膜病毒样颗粒是标准结合物分析的特例。就形成衣壳的蛋白质的总摩尔质量而言，它们的结构成分往往非常明确，而且基因组有效载荷也非常具体。 SEC-MALS-UV-dRI 方法确定衣壳分子量和平均有效载荷分子量，从中可以计算空衣壳和完整衣壳的比例——即使它们在 SEC 中共同洗脱。虽然不太精确，但可以使用 MALS 和在两个 UV 波长（通常为 260 nm 和 280 nm）下的吸收进行相同的分析。

原理

ASTRA 的病毒载体分析扩展了标准结合物分析，不仅可以确定蛋白质和核酸成分的摩尔质量，还可以确定 Vg/Cp、全基因组与总衣壳的比率，以及总衣壳、空心和实心衣壳的总浓度.它还量化了总体水平，因此在一次运行中总共量化了三个关键质量属性 (CQA)。

由于 SEC-MALS 方法独立于 AAV 血清型，不需要试剂或特殊处理，并且由标准 HPLC 仪器自动化，因此它适合作为涵盖多种 AAV 产品以及开发、制造和质量控制的所有阶段的平台方法。 Wyatt 为使用 SEC-MALS 开发 AAV 分析的标准操作程序提供了广泛的指导。点击了解更多有关于基因载体表征和 Wyatt AAV 服务。

复合纳米粒子通常由结构分子和有效载荷组成。对于共轭大分子，采用 SEC 或场流分离 (FFF) 等分离技术的 MALS-UV-dRI 检测是表征此类二元复合纳米粒子的大小和组成的重要方法。然而，由于它们的尺寸较大，通过这种方法分析纳米粒子存在一定的挑战，ASTRA 的新型纳米共轭分析算法克服了这些挑战。针对于这个尺寸范围的产品，并且可以进行纳米共轭分析——包括：

• 包裹 RNA 或 DNA 有效载荷的脂质纳米颗粒 (LNP)
• 封装小分子药物或肽有效载荷的脂质体或 PLGA 复合物
• 数兆道尔顿摩尔质量范围内的蛋白质-多糖疫苗

原理

偶联物分析依赖于准确的紫外测量。当颗粒或大分子的半径大约在 30 nm 以上时，分析物本身对检测器中入射紫外光的散射变得显着。这会导致检测器有明显的紫外消光信号，即使改颗粒没有任何吸收。例如，空脂质体在 260 nm 下不吸收紫外线，但由于散射而产生明显的紫外线信号。如果将这些 UV 数据应用于标准结合物分析会产生错误的结果。

纳米共轭分析表征了紫外检测器对空脂质颗粒或未共轭多糖在一定尺寸范围内的散射的响应，该尺寸范围涵盖了负载的纳米颗粒或共轭聚合物的尺寸。然后将该信息应用于专有算法，以量化样品中的核酸或药物有效载荷或结合蛋白。由于分析发生在每个洗脱点上，因此有效载荷被确定为大小的函数。

仪器

如果样品在大小和稳定性方面与该方法兼容，则纳米偶联物分析可与 SEC 结合使用。较大的颗粒或可能在剪切力下降解的颗粒可以使用 Wyatt 的 Eclipse^™ FFF 系统通过场流分离 (FFF) 进行分离。 Eclipse 由行业标准 HPLC 模块支持，并与 Wyatt 的 MALS 和 dRI 检测器无缝结合。