PL9006: 多角度动态光散射表征疫苗的主要出版物

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为了确保疫苗的安全和有效性,必须在发现、开发、生产和质量控制过程中使用可靠的表征工具。

怀雅特的解决方案系统分析了关键的疫苗属性,包括:

  • 摩尔质量和大小
  • 病毒物理效价和核酸含量
  • 聚集体
  • 热稳定性和胶体稳定性

其中许多分析可以简化和自动化,以实现高通量。

我们的技术也有助于疫苗研究和工艺开发,研究抗体-抗原复合物的结合亲和力和化学计量,表面糖蛋白的寡聚状态,或优化配方条件。

继续阅读,了解怀亚特产品如何应用于特定疫苗类别的特性。

我们的白皮书《WP9007: 利用光散射表征疫苗》也可在下面下载。

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mRNA/DNA

基于mRNA或DNA的疫苗通常通过脂质纳米粒、病毒样颗粒或其他纳米颗粒载体进行传递。多角度和动态光散射(MALS,DLS)可用于表征mRNA本身、载体粒子和完整疫苗。

mRNA生物物理属性

如应用说明《AN1616:SEC-MALS方法描述mRNA》所述,mRNA的关键生物物理属性可以通过SEC-MALSDLS进行量化。该分析确定了分子量、聚集体的百分比、回转半径Rg和流体动力学半径Rh。MW 和Rg之间的关系表明了单链或双链RNA,而Rg:Rh的比值则表示分子的构象。

这种方法可以很容易地用于进一步研究这些属性是如何受到mRNA制备、配方和储存条件的影响的。

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LNP运载工具的特性

脂质纳米粒(LNPs)包括纳米乳剂、胶束和固体脂质纳米粒。淋巴结摄取抗原呈递细胞的最重要参数之一是大小。只有直径小于约150 nm的LNP被吸收,而较大的LNP保留在注射部位。这为性能最好的LNP提供了一个标准。

FFF-MALS可以测定较大颗粒的粒径分布,量化每个粒级的颗粒浓度,以精确确定LNP mRNA载体的有效性。Wyatt Technology提供基于Eclipse™ FFF DAWN® 多角度光散射检测器的一键式FFF-MALS系统,以及用于方法开发,仪器控制,数据采集和分析的综合软件。 有关FFF-MALS在LNP表征中的应用的更多详细信息,请参见WP2608: Lipid nanoparticle and liposome characterization with FFF-MALS

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LNP流程开发和分析

一旦开发出成功的LNP / mRNA平台,实时多角度光散射(RT-MALS)便有助于扩大规模。 通过在线或联机的ultraDAWN™,可以实现对关键质量属性(如尺寸和摩尔质量)的连续监控。 AN8006中描述了如何在生产环境中实时监测脂质体的大小。

下载 AN8006

SEC-MALS-DLS可以确定mRNA的绝对分子量和大小值,即使这些分子的洗脱与球蛋白标准品(如甲状腺球蛋白)完全不同。

完整的SEC-MALS系统包括HPLC,UV检测器,SEC柱,MALS和RI检测器。 且由ASTRA®软件执行控制,数据采集和分析。

病毒(灭活或减毒活病毒)

这些复杂的疫苗产品通常与佐剂结合多种血清型。非对称场流分级分离(AF4)通过高分辨率将大小复杂的样品分离。在分离之后,使用多种在线仪器进行下游分离,包括MALS,DLS,UV和荧光检测器,以完成生物物理表征。

产品验证

在对流感病毒亚群的分析中,FFF-MALS详细量化了大小和总颗粒浓度。与透射电镜结果比较,病毒浓度误差在2%以内,大小在5%以内。还发现了一个小的二聚体峰。

作为FFF-MALS的补充,DynaPro® Plate Reader可针对处理条件和配方提供数百种样品的高通量筛选。除了确定大小外,该技术还能够筛选病毒样品的热稳定性并确定病毒颗粒浓度。

补充文献

参见http://doi.org/10.1016/J.JVIROMET.2007.04.008 以探索FFF-MALS分析与其他方法的比较,例如透射电子显微镜(TEM),原子力显微镜(AFM),尺寸排阻色谱法结合MALS(SEC-MALS),定量逆转录聚合酶链反应(RT Q-PCR),组织培养中值剂量(TCID50)和荧光聚焦测定(FFA)。

FFF-MALS是用于疫苗鉴定的出色工具。 可以用高分辨率对每个亚群定量总病毒计数和大小。

病毒样颗粒(VLP)

重组病毒样颗粒的设计以与传统减毒活疫苗相同的方式引发免疫应答,通常由蛋白质衣壳和核酸组成。 SEC-MALS和FFF-MALS既可表征衣壳也可表征填充物,而DLS适合用作确定大小,聚集和病毒物理滴度的质量控制工具。

监控生产过程:测量蛋白质衣壳和DNA填充物

VLP的合成涉及三个步骤:1)从细胞培养物中分离重组VLP;2)将病毒分解成五聚体,去除所有DNA;3)引入目的DNA并包装成新的VLP。

FFF-MALS用于监测这一过程,通过分离和检测完全形成的衣壳从聚集物、未组装的原生质体和帽体。分析报告了构象,并在过程的最后一步,同时测量蛋白质和DNA摩尔质量,以量化有效载荷。

补充文献

PL2609: FFF-MALS-DLS nanoDDS key publications 包含了对出版物的引用,这些出版物着重强调了使用FFF-MALS来表征脂质体,聚合体,病毒样颗粒和其他潜在的基因载体递送载体。

 

查看网络视频会议“VLP表征:光散射生物物理工具箱”,了解表征VLP及其与中和抗体相互作用的其他方法。

 
高通量筛选

请参阅http://doi.org/10.1016/j.bej.2015.04.004以了解一种快速简单的筛选方法,该方法基于使用DynaPro Plate Reader的高通量动态光散射,用于识别增强由capsomer组成的模块化候选疫苗稳定性的条件。

 

ASTRA软件同时测定VLP和蛋白质的摩尔质量分布,以量化DNA有效载荷。

DynaPro Plate Reader可快速筛选配方的大小和稳定性。

多糖和糖复合物疫苗

多糖和蛋白糖复合物疫苗将佐剂与高分子量多糖抗原结合,通常包括几种血清型。在蛋白质-糖复合物中,蛋白质佐剂与多糖直接共价连接。

由于分子量是这类疫苗免疫原性的核心,SEC-MALS和FFF-MALS对其特性鉴定和质量控制至关重要。

尺寸和摩尔质量表征

FFF‐MALS结合Eclipse FFFDAWN MALS 检测器, Optilab® dRI 检测器和行业标准HPLC组件,是表征蛋白质-多糖结合疫苗的首选方法,该疫苗的MDa含量超过数十或数百MW。由于没有柱状基质,因此在分离整个范围时不会出现剪切诱导降解;MALS可以同时确定摩尔质量和大小。

对于较小的分子,SEC-MALS可能更容易被利用。一般来说,SEC-MALS不仅可以测定分子的总摩尔质量,还可以量化每个洗脱部分的蛋白质含量和多糖含量。SEC-MALS系统包括HPLC泵、自动进样器和色谱柱、DAWN和Optilab,还可能包括ViscoStar® 差分粘度计,用于额外的构象分析。

关于蛋白质-多糖结合疫苗和其他疫苗类型的更多详细分析,请参阅我们的视频会议 Vaccines, Well Characterized? Light scattering solutions for biophysical characterization in vaccine R&D。

附加文献

AN8005: RT-MALS end-point determination of a polysaccharide depolymerization process描述了ultraDAWN实时MALS检测器如何在加工过程中监测多糖分子量,以确保生产车间的最佳质量。

AN1306: Polyvalent pneumococcal polysaccharide vaccine characterized by SEC-MALS描述了MALS如何用于疫苗质量控制。

FFF-MALS精确表征了大型蛋白质-多糖共轭物的摩尔质量和大小分布。

DAWN MALS检测器可量化高达数百MDa的摩尔质量。