了解场流分离系统

AF4通道的结构

图1中描述的AF4原理由Giddings在一篇综述文章¹中有讲解。简单地说，分离发生在渠道中，渠道由两个狭长的块体组成，块体之间用一个垫片栓接在一起。间隔层是一种典型厚度仅为100至500µm的聚合物箔。这种薄带状通道内的流动是层流的，具有明显的抛物线流动轮廓，驱动颗粒分离。

所述半透膜包括由熔块支撑的底部块。膜对溶剂可渗透，但对分析物不可渗透；通过选择适当的膜孔径（从1 kDa到100 kDa），可以保证这一基本功能。

AF4原理

含有颗粒的载液与膜平行流动，但通道末端的收缩迫使部分流体通过膜，从而形成一个“交叉流场”，使颗粒向膜集中。扩散作为一种反作用力，驱动颗粒返回通道，导致膜上方的高度分布取决于颗粒的平动扩散系数D_t、流体动力学半径R_h以及横流速度²。分离产生于层流中根据颗粒在膜上的高度不同的输送速度。

在FFF中，颗粒停留时间t_R取决于D_t、通道厚度w、横向流速Fc（由精确的流量控制器控制）和检测器流速F_out。如果流速随时间保持恒定且保留率足够高，则保留时间近似于公式1²：

t_R = w²/6D_t x ln⁡(1+ F_c/F_out)       Eq. 1

对于更复杂的流动剖面，样品在通道出口处的保留时间、区域加宽和稀释可通过标准流体动力学³计算。通过对分离过程的计算机模拟，可以对分离方法进行虚拟优化，并根据测量的保留时间计算扩散系数⁴。图2显示了FFF出色的分离能力示例。

AF4程序

使用AF4分离，没有柱介质与样品相互作用，因此对于非常高摩尔质量的聚合物，无需担心施加剪切力。整个分离过程是温和、快速和无损的，没有可能相互作用、降解或改变样品的固定相。

分离过程需要三个步骤：在注入和聚焦的前两个步骤中，主流被分离，从两端进入通道。在这段时间，流动将只向下移动并通过膜。当样品被注入时，它被聚焦在某一位置上，并向膜集中。该位置取决于进口和出口的流量比——进口的较高流量将焦点位置移向下游。

有两种注射模式： ‘tip injection’ 和 ‘focus-zone injection’。

• Tip injection：样品通过进样口进入，沿膜流动，直至到达聚焦位置。简单是这个通道设计的优点，但在聚焦过程中可能会丢失样品的缺点。Eclipse通道不使用此模式，但它在Eclipse控制器中可用于SEC列。
• Focus-zone injection: 通过位于聚焦位置正上方的单独端口，独立于入口流注入样品。从入口和出口流出的流量比例是平衡的，以便直接在注入口下方汇合。这需要一个额外的注入口，但有一个好处是在聚焦过程中完全保留样品。除Dispersion入口通道（不聚焦样品）外的所有Eclipse通道均在此模式下运行。

样品体积完全转移后，停止注射流，通常在流型切换到洗脱模式之前需要等待一分钟。

在洗脱步骤中，水相仅从入口进入，从与探测器相连的出口流出。样品成分根据大小进行洗脱，并由检测器阵列进行监测。

¹ Giddings, J. C. A New Separation Concept Based on a Coupling of Concentration and Flow Nonuniformities. Sep. Sci. 1, 123–125 (1966).

² Wahlund, K. G. & Giddings, J. C. Properties of an Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation Channel Having One Permeable Wall. Anal. Chem. 59, 1332–1339 (1987).

³ Litzen, A. & Wahlund, K. G. Zone broadening and dilution in rectangular and trapezoidal asymmetrical flow field-flow fractionation channels. Anal. Chem. 63, 1001–1007 (1991).

⁴ Elsenberg, S. & Johann, C. Field-Flow Fractionation: Virtual Optimization for Versatile Separation Methods | LCGC. The Column http://www.chromatographyonline.com/field-flow-fractionation-virtual-optimization-versatile-separation-methods-0 (2017).

EAF4包含垂直于膜片施加的附加电场。 带电粒子显示出膜上方的高度偏移，以及保留时间的相应偏移，该偏移随施加的场强而变化，由此可以计算出电泳迁移率µ_E和zeta电位。 该方法可以同时可靠地确定多个成分的µ_E，从而提供电荷分布的指示⁵。 EAF4在配备Mobility™模块和通道的Eclipse中实现。

⁵ Johann, C., Elsenberg, S., Schuch, H. & Rösch, U. Instrument and Method to Determine the Electrophoretic Mobility of Nanoparticles and Proteins by Combining Electrical and Flow Field-Flow Fractionation. Anal. Chem. 87, 4292–4298 (2015).