光散射理论介绍
光散射包括一套通用的技术，用于表征大分子和溶液中的各种颗粒。 与大多数表征方法相比，它不需要外部校准标准。 从这个意义上讲，这是绝对的测量方法。
Wyatt 仪器进行两种不同类型的光散射测量，以进行绝对分子表征：
- 多角度光散射（MALS），静态光散射（SLS）或经典光散射 - 在MALS中，散射光的强度是角度的函数。 对于远小于入射光波波长的大分子，分析数据以确定摩尔质量或分子量 Mw和均方根半径Rg。 对于某些尺寸在入射光波长附近的粒子，MALS可以帮助确定形状和结构。
通过散射强度的浓度依赖性，可以将分子相互作用量化为第二维里系数（对于非特异性相互作用为A2）或平衡解离常数（对于非特异性相互作用为KD）。 - 动态光散射（DLS）或 Quasi-elastic 光散射（QELS） - 在DLS测量中，使用快速光子计数器测量散射光信号中随时间变化的波动。 DLS测量可以确定大分子或颗粒的扩散系数，并据此计算流体力学半径。
光散射可以是单机 或 色谱模式应用的技术。 每种技术在表征分析物的不同特性方面都有其优点和缺点。 阅读解决方案部分，以更好地了解如何将不同的技术应用于各种表征挑战。
为什么会有光散射？
尽管也可以通过质谱分析，膜渗透压测定和沉降平衡（分析离心）确定绝对分子量，但只有光散射覆盖了如此大范围的大分子，包括其低聚状态。 最重要的是，光散射允许测量大分子的溶液性质。 沉降平衡运行可能需要72个小时，但尺寸排阻色谱/光散射研究可能会在一小时之内完成，而单机模式分析将在几分钟内完成。 这些相对较短的运行时间加上对摩尔质量，尺寸和A2的绝对测定，使光散射成为准确和快速进行大分子表征的首选方法。
联机模式
在联机模式中光散射实验将多角度静态光散射 (MALS) 检测器（例如DAWN® 或miniDAWN®）与基于大分子物理特性分离大分子的分离装置相结合。 MALS 最常用的分离方法是 HPLC 尺寸排阻色谱 (SEC)。 SEC-MALS 提供摩尔质量和大小（均方根半径 Rg）的准确分布，而不是：
- 标准 SEC，取决于参考标准的色谱柱校准。
- 单机（比色皿）模式 MALS，在该模式下，测量的数量在样品中存在的所有质量和尺寸上取平均值。
与传统的色谱柱校准方法相比，这种表征方式有许多优点。由于测量每个洗脱部分的光散射和浓度，因此可以独立于洗脱位置确定摩尔质量和大小。这对于具有非球形形状或与 SEC 色谱柱相互作用的物质尤为重要；此类物质通常不会以一组柱校准标准所描述的方式洗脱。
然而，对于联机模式下的光散射，非标准色谱柱相互作用没有问题，因为绝对摩尔质量和大小是为每个洗脱级分确定的。由于没有必要对校准标准的使用做出任何固有的假设，因此可以完全表征源自分离技术（例如离子交换或反相色谱）的分布。没有办法通过传统方法校准这些技术。
另一种经常与 MALS 结合使用的强大分离技术是场流分离 (FFF)，它可以在非常宽的动态范围内进行分离。 FFF 的通道在没有填充柱的情况下工作。 Eclipse™ 精确控制流量以获得多功能和稳定的分离。 FFF-MALS 可表征从小分子到微米级纳米颗粒的溶质和悬浮液。
在典型的 SEC-MALS 或 FFF-MALS 测量中，光散射检测器和浓度检测器串联连接在分离装置之后。浓度检测器通常是差示折射计 (dRI)，例如 Optilab® 或紫外吸收 (UV) 检测器。
除了通过 MALS 测量摩尔质量和均方根半径外，还可能需要确定流体动力学半径。这是通过向 MALS 检测器添加动态光散射 (DLS) 检测模块（例如 WyattQELS 或用于测量流体动力学半径 Rh 的 DynaPro® NanoStar® 外部光纤）来实现的。 SEC-DLS 和 FFF-DLS 尺寸测量范围从 < 1 nm 到 > 250 nm。
或者，可以将诸如 ViscoStar® 之类的差示粘度计与 MALS 和 dRI 检测器串联，以确定特性粘度，特性粘度也可能与 Rh 相关。由 DLS 或粘度测定法确定的摩尔质量和大小之间的关系表示分子构象。
单机模式
有时，必须或希望对未分离的样品进行光散射测量。例如，可能需要样品的时间依赖性或浓度依赖性特性。此类测量统称为单机测量，通过将样品等分试样直接注入流通池，或将样品放入容器（例如 microCuvette™）中，然后导入 DAWN® MALS 检测器来进行。
可以在单机光散射测量中确定的特性取决于测量技术。在多角度（静态）光散射中，不同质量物质的存在意味着测量的数量是平均数量。例如，摩尔质量是重均摩尔质量，并且尺寸在质量分布的较高矩上平均。但是，如果在多个浓度下进行单机测量，则可以确定第二维里系数 A2 以量化溶质-溶质或溶质-溶剂相互作用——这在蛋白质配方或晶体学等研究中非常有用。
DLS（动态光散射）的单机测量确定了流体动力学半径分布的半定量方面。使用正则化等分析技术（参见 ASTRA® software 软件），单机 DLS 数据可以揭示广泛多分散样本的大小分布（超过几个数量级），如果大小差异大于半径的三到五倍，甚至可以区分群体。
虽然联机模式通常是表征样品中摩尔质量和尺寸分布的最佳方法，但单机模式在无法通过尺寸排阻色谱轻松分离大分子的情况下非常有用，或样品的时间或浓度依赖性值得关注的情况下非常有用。后者可能包括对蛋白质自组装、浓度依赖性聚集测量等现象的研究。可以使用 Calypso® 成分梯度系统和 CALYPSO™ 软件对未分馏样品的浓度依赖性和时间依赖性研究进行自动化和分析。有关与 MALS 交互特征背后的理论的更多详细信息，请参阅 CG-MALS。
