多角度光散射(MALS)和动态光散射(DLS)构成了任何生产或研究蛋白质的设施必不可少的生物物理表征功能。
 

蛋白质类

Protein

蛋白质和相关的生物大分子是复杂的实体,与其他生物分子相互作用时表现出令人着迷的行为。光散射提供了一种简单有效的方法来表征蛋白质的基本生物物理特性:摩尔质量,大小,电荷,相互作用,结合和构象。

认证

摩尔质量 是鉴定蛋白质,其寡聚体或复合物的关键,但是太多的蛋白质研究人员依赖于通过 SDS-PAGE 或传统的尺寸排阻色谱法对分子量进行简单,无效的分析。 这些技术引用了构象和理想基质相互作用的假设,这可能使科学家蒙昧不清或完全不正确的结果,从而导致从根本上对科学出版物的数据解释不准确。

多角度光散射与SEC(SEC-MALS)结合使用,可准确测定蛋白质,寡聚体和复合物的分子量,无论构象或非理想的色谱柱相互作用如何。 这是因为 SEC-MALS 构成了对摩尔质量的严格的第一性原理分析,它不依赖保留时间或参考分子的校准。 SEC 色谱柱的唯一功能是按大小分离分子,而 MALS 独立确定洗脱蛋白的摩尔质量。

共轭和膜蛋白

由于表面活性剂胶束包围着蛋白质,用去污剂溶解的膜蛋白特别难以用传统技术甚至质谱分析。变性的 SDS-PAGE 会使天然的低聚物解离并妨碍其鉴定,而交联质谱可以产生溶液中不存在的低聚物。

同样,糖基化程度高的蛋白质无法用参考标准或球形蛋白质的通用模型来表示,因此不适合采用传统技术进行分析。

通过结合 SEC(SEC-MALS)的多角度光散射可以解决这些挑战,通过结合来自 SEC 分离后的三个下游检测器的数据:UV,MALS 和示差折光率(dRI),可以区分蛋白质及其相关的去污剂或碳水化合物。 ASTRA 的结合分析 算法可计算蛋白质成分和结合或胶束成分的摩尔质量。蛋白质的真正寡聚或复合状态以及糖基化程度是可以确定的。

纯化与聚集

科学家们对蛋白质及其生物学功能进行了详细的机械研究,但不能用劣质的材料工作。光散射提供了两种不同的评估蛋白质样品质量和纯度的方法:动态光散射(DLS)和与多角度光散射耦合的尺寸排阻色谱(SEC-MALS)。

DLS 是获得蛋白质溶液中聚集和杂质的快速,定性估计的极佳方法,且样品消耗量最少仅为1.25 µL。无需分离步骤;只需将几滴样品移入微量比色皿或多孔板中,您将在几秒钟内获得尺寸分布 。特别是大的亚微米聚集体很容易通过 DLS 进行鉴定的,以及通过多分散性参数可溶聚集体的存在。单机(未分级)DLS 甚至可以回收珍贵的样品,即使在测量中仅使用了几微升也是如此。

尽管 DLS 可以测量尺寸的粗略分布(流体动力学半径),但您可能需要区分和定量二聚体和三聚体等小的聚集体,或者获得杂质或降解物的准确标识。 SEC-MALS 使用绝对摩尔质量测量值进行真正的分离,以便可靠地指示溶液中存在哪些蛋白质和降解物。

天然低聚状态

到底什么是“天然寡聚态”?答案可能会让您感到惊讶,因为“天然”是一个相对术语。大多数生物低聚物由在单体和特定低聚物(例如,二聚体或四聚体)之间动态平衡的蛋白质组成。低聚物与单体的比例取决于浓度以及缓冲液的 pH 和离子强度,因此会随分析条件而变化。天然低聚物的真正鉴定必须完全在溶液中进行,因为溶液条件决定了低聚度,甚至最终的低聚数。

多角度光散射(MALS)是识别天然低聚物并确定其化学计量的主要方法之一。寡聚化通常可以通过 SEC-MALS 进行初步诊断,这可能表明蛋白质的摩尔质量与单体序列的重量明显不同,或者该质量可能在洗脱峰上变化,并随顶点两侧浓度的降低而降低。可以通过一些其他的由不同起始浓度组成的SEC-MALS测量获得验证。

为了获得对低聚物状态和平衡解离常数 Kd 的严格分析,组成梯度多角度光散射(CG-MALS)将自缔合作为一系列停止流注入 MALS 检测器的方式进行测量。即使存在一种以上的低聚物,该程序也可以实现低聚物化学计量的完全平衡和完整分析。

动态光散射(DLS)虽然不如 MALS 定量,但它是一种通过平均分子大小的浓度依赖性来估计低聚性质的快速有效的手段。

生物分子相互作用

蛋白质与可逆复合物的结合是我们所知的许多生物学的基础,无论是为了信号传递、细胞结构的形成、细胞分裂、免疫反应,还是为了维持一个健康、正常运转的有机体所必需的其他过程。许多蛋白质-蛋白质相互作用很难通过传统的方法进行分析,如细胞分析、凝胶转移分析,甚至是生物物理技术,如表面等离子体共振或等温滴定量热法,这是由于复杂的现象,如多价性、协同性、多蛋白组装,或者是自我和异性恋的结合。

无需标记或固定化即可表征溶液中蛋白质和其他生物分子相互作用的最通用技术之一是成分梯度多角度光散射(CG-MALS)。在这种技术中,Calypso II 自动制备一系列组成或浓度,并将其作为停流进样输送至 DAWNminiDAWN MALS检测器。 CALYPSO 软件使用这些 MALS 测量值来确定溶液的重均摩尔质量作为成分的函数,然后评估数据与关联方案的拟合度,以便确定数据是否支持特定模型并进行量化结合常数(Kd)。该软件提供了由一个或两个相互作用的物种组成的实质上无限多种的关联模型,从而可以分析自我关联,异质关联,组合的自我和异质关联,多价相互作用和合作结合。

CG-MALS 的真正功效来自其对摩尔质量的绝对评估,这消除了多蛋白复合物的低聚状态和化学计量的确定中的所有歧义。在 CALYPSO 软件的仿真功能的辅助下,方法开发简单明了。

SAXS 和 SANS

Beam time 是昂贵且难以获得。 为了充分利用您的 SAXS 和 SANS 测量结果,您需要确保生物分子到达腔室之前的质量。

DLS 是一种快速简便的方法来检查样品中的总体聚集。 您可以在 DynaPro NanoStar 的 microCuvette 中使用低至 1μL,甚至在必要时进行回收! 我们专有的一次性比色皿仅需要 4μL。

为了进一步表征低聚物以及与 X-射线或中子散射结果进行比较,非常有必要将您的 SEC 与 miniDAWN MALS检测器和 Optilab RI 检测器相结合使用。详情参见 Bazin et al., "Structure and primase-mediated activation of a bacterial dodecameric replicative helicase" Nucleic Acids Res., 2015, 1

部分文献

Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol. Biol.  2006, 328, 97-112.

Kim, Y.; Babnigg, G.; Jedrzejczak, R.; Eschenfeldt, W. H.; Li, H.; Maltseva, N.; Hatzos-Skintges, C.; Gu, M.; Makowska-Grzyska, M.; Wu, R.; An, H.; Chhor, G.; Joachimiak, A. High-throughput protein purification and quality assessment for crystallization. Methods  2011, 55, 12-28.

Laurén, J.; Gimbel, D. A.; Nygaard, H. B.; Gilbert, J. W.; Strittmatter, S. M. Cellular prion protein mediates impairment of synaptic plasticity by amyloid-β oligomers. Nature  2008, 457, 1128-1132.

Monterroso, B.; Ahijado-Guzmán, R.; Reija, B.; Alfonso, C.; Zorrilla, S.; Minton, A. P. ; Rivas, G. Mg2+-linked self-assembly of FtsZ in the presence of GTP or a GTP analog involves the concerted formation of a narrow size distribution of oligomeric species. Biochemistry  2012, 51, 4541-4550.

Solmaz, S. R.; Chauhan, R.; Blobel, G.; Melčák, I. Molecular architecture of the transport channel of the nuclear pore complex. Cell  2011, 147, 590-602.

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