FFF MALS trennt und analysiert Makromoleküle und Partikel ohne Säulenbett und eignet sich so, um die echte molare Massen- und Radienverteilungen zu bestimmen.
 

Grundlagen der Fluss-Feldflussfraktionierung

Asymmetrische Fluss-Feldflussfraktionierung (AF4)

Die Asymmetrische Fluss-Feldflussfraktionierung (Flow Field-Flow Fractionation, AF4) ist eine vielseitige Trenntechnik, die Makromoleküle und Nanopartikel von
1 - 1000 nm mit Hilfe des Eclipse-Instrumentes trennt.


Wie die AF4 nach Größe trennt

Aufbau des AF4 Kanals

Das Prinzip der AF4, dargestellt in Abbildung 1, wurde von Giddings in einem Übersichtsartikel1 beschrieben. Die Fraktionierung findet in einem offenen Kanal statt, der aus zwei langen, schmalen Blöcken besteht, die miteinander verschraubt sind und zwischen denen sich ein Abstandshalter (Spacer) befindet. Der Abstandshalter ist eine Polymerfolie mit einer typischen Dicke von 100 bis 500 µm. Neu entwickelte Kanäle haben alternativ die Kanalform im Deckel ausgefräst. Die Strömung innerhalb dieses Kanals ist laminar, mit einem ausgeprägten parabolischen Strömungsprofil, das mit für die Fraktionierung verantwortlich ist.

 



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Abbildung 1: Trennmechanismus in einem AF4-Kanal, bestehend aus einer semipermeablen Membran und einem geregelten Fluss, der einen Teil des Lösungsmittels zum Durchströmen der Membran zwingt. Das radius-abhängige Gleichgewicht zwischen Diffusion und Querströmung führt zu unterschiedlichen Höhenverteilungen für verschiedene Partikel mit verschiedenen Radien. Kleinere Partikel werden früher aus dem Kanal gespült als größere Partikel, die in der Nähe der Membran bleiben und eine geringere Strömungsgeschwindigkeit erfahren.



Der untere Bereich besteht aus einer semipermeablen Membran, die von einer Fritte unterstützt wird. Die Membran ist durchlässig für das Lösungsmittel, aber nicht für den Analyten. Diese wesentliche Funktion wird durch die Wahl der geeigneten Porengröße der Membran, ausgedrückt als Molekulargewichts-Cutoff (MWCO) im Bereich von 1 kDa bis 100 kDa, gewährleistet.

 



Prinzip der AF4

Lösungsmittel und Probe fließen parallel zu der Membran. Eine Flussregelung leitet einen Teil des Lösungsmittels durch die Membran, wodurch ein Querströmungsfeld (Cross-Flow Field) entsteht, dass die Probe zur Membran hin konzentriert. Die Diffusion wirkt als Gegenkraft, die die Probe zurück in den Kanal treibt, was zu einer Höhenverteilung über der Membran führt, die vom translatorischen Diffusionskoeffizienten Dt der Partikel und damit vom hydrodynamischen Radius Rh, sowie von der Querströmungsgeschwindigkeit2 abhängt. Die Fraktionierung ergibt sich aus der unterschiedlichen Transportgeschwindigkeit im laminaren Strömungsprofil in Abhängigkeit von der Höhe der Probe über der Membran.

Bei der AF4 ist die Partikelverweilzeit tR abhängig von Diffusionskoeffizienten Dt, der Kanaldicke w, der Querströmungsgeschwindigkeit Fc (die durch einen Durchflussregler gesteuert wird) und der Detektorflussrate Fout. Wenn die Flussraten über die Zeit konstant sind und die Retention ausreichend hoch ist, ist die Retentionszeit in guter Näherung durch Gl. 12 gegeben:

tR = w2/6Dt x ln⁡(1+ Fc/Fout)       Gl. 1

Retentionszeit, Zonenverbreiterung und Verdünnung der Probe am Kanalausgang für komplexere Strömungsprofile können mit Hilfe der Standard-Fluiddynamik3 berechnet werden. Die Computersimulation des Trennprozesses ermöglicht die in-silico Optimierung des Trennverfahrens sowie die Berechnung von Diffusionskoeffizienten auf der Grundlage der gemessenen Retentionszeit4. Ein Beispiel für die hervorragenden Trennleistung der AF4 ist in Abbildung 2 dargestellt.

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Abbildung 2: AF4-Trennung einer Partikel-Mischung mit ausgezeichneter Auflösung. Die Größe und Heterogenität jeder Partikelpopulation wird aus den einzelnen eluierenden Fraktionen (Slice) berechnet./p>



Durchführung eines AF4 Experimentes

Bei der AF4 gibt es kein Säulenmedium, das mit den Proben interagiert, so dass Polymere mit sehr hoher molarer Masse schonende, ohne Scherkräfte zu erfahren, fraktioniert werden können. Die AF4 Trennung ist schonend, schnell und zerstörungsfrei und ohne stationäre Phase, die mit der Probe interagieren, sie abbauen oder verändern könnte.

Der AF4 Trennvorgang läuft in drei Schritte ab: Während der ersten beiden Schritte, Injektion und Fokussierung, wird der Hauptstrom geteilt und tritt von beiden Enden in den Trennkanal ein. In diesem Modus fließt das Lösungsmittel nur nach unten durch die Membran. Wenn die Probe injiziert wird, wird sie in einem schmalen Bande fokussiert und dicht über der Membran konzentriert. Die Position der Bande hängt vom Verhältnis der Flussraten aus Kanaleinlass und Kanalauslass ab. Ein höherer Fluss aus dem Kanaleinlass verschiebt die Fokusposition stromabwärts.

Es stehen zwei Injektionsmodi zur Verfügung: "Tip Injection" und "Focus-Zone Injection".

  • Tip Injection: Die Probe wird über den Kanaleinlass injiziert und fließt entlang der Membran, bis sie die Fokusposition erreicht. Der Vorteil dieses Verfahrens ist eines einfacheren Kanaldesigns, hat aber den Nachteil eines möglichen Probenverlusts während der Fokussierung. Eclipse Kanäle verwenden diesen Modus nicht, aber er ist in der Eclipse für die Verwendung mit SEC-Säulen verfügbar.
  • Focus-zone Injection: Die Probe wird unabhängig vom Kanaleinlass über einen separaten Port, der sich direkt über der Fokussierposition befindet, injiziert. Das Verhältnis der Flüsse vom Einlass- und Auslass-Port ist so ausbalanciert, dass sie sich direkt unter dem Injektions-Port treffen. Dies erfordert einen zusätzlichen Injektionsanschluss am Kanal, hat aber den Vorteil, dass die Probe während der Fokussierung nicht über die Membran fließen muss. Alle Eclipse Kanäle, außer dem Dispersionseinlasskanal der die Probe nicht fokussiert, arbeiten in diesem Modus.

Nach der vollständigen Injektion des Probenvolumens wird der Injektionsfluss gestoppt und das System verbleibt einige weitere Minuten im Fokussiermodus, bevor auf Elutionsmodus umgeschaltet wird.

Im Elutionsmodus tritt der Fluss nur über den Kanaleinlass ein und am Kanalauslass aus, um dann durch die Detektoren zu fließen. Die Probenbestandteile eluieren getrennt nach Größe und werden in den Detektoren charakterisiert.

1 Giddings, J. C. A New Separation Concept Based on a Coupling of Concentration and Flow Nonuniformities. Sep. Sci. 1, 123–125 (1966).

2 Wahlund, K. G. & Giddings, J. C. Properties of an Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation Channel Having One Permeable Wall. Anal. Chem. 59, 1332–1339 (1987).

3 Litzen, A. & Wahlund, K. G. Zone broadening and dilution in rectangular and trapezoidal asymmetrical flow field-flow fractionation channels. Anal. Chem. 63, 1001–1007 (1991).

4 Elsenberg, S. & Johann, C. Field-Flow Fractionation: Virtual Optimization for Versatile Separation Methods | LCGC. The Column http://www.chromatographyonline.com/field-flow-fractionation-virtual-optimization-versatile-separation-methods-0 (2017).

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Abbildung 3: AF4-MALS-DLS-Trennung von Blutserum, mit abgetrennten Peaks für Serumalbumin, IgG und verschiedene Arten von Lipoproteinen. Hydrodynamische Radien Rh wurden durch online Dynamische Lichtstreuung, die in den DAWN-MALS-Detektor integriert ist, bestimmt.


Elektrische Asymmetrische Fluss Feld-Fluss Fraktionierung

Die Elektrische Asymmetrische Fluss Feld-Flussfraktionierung (EAF4) beinhaltet ein zusätzliches elektrisches Feld, das senkrecht zur Membran angelegt wird. Geladene Partikel reagieren auf das elektrische Feld mit einer Höhenverschiebung und der damit verbundenen Änderung der Retentionszeit. Die Änderung der Retentionszeit variiert mit der angelegten Feldstärke, woraus die elektrophoretische Mobilität µE und das Zetapotenzial berechnet werden. Mit dieser Methode kann µE für mehrere Komponenten gleichzeitig bestimmt werden und man erhält einen Hinweis auf die Ladungsverteilung5. EAF4 ist mit der Eclipse und dem MobilityTM-Modul und Kanal möglich.

5 Johann, C., Elsenberg, S., Schuch, H. & Rösch, U. Instrument and Method to Determine the Electrophoretic Mobility of Nanoparticles and Proteins by Combining Electrical and Flow Field-Flow Fractionation. Anal. Chem. 87, 4292–4298 (2015).

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Abbildung 4: In EAF4 wird die Verschiebung der Retentionszeit aufgrund des elektrischen Feldes analysiert, um das Zetapotenzial und die elektrophoretische Mobilität jedes eluierenden Peaks zu bestimmen.




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Abbildung 5: Die Fraktionierung in EAF4 erfolgt sowohl nach Größe als auch nach Ladung. Für geladene Partikel wird die Gleichgewichtshöhe über der Membran (und damit die Retentionszeit) entsprechend dem Vorzeichen und der Größe des angelegten Feldes verschoben.