Instrumente für Mehrwinkel-Lichtstreuuungs (MALS) und High-Throughput Dynamische Lichtstreuung (DLS) sind leistungsstarke Werkzeuge für die Charakterisierung von Biotherapeutika über viele Hilfsstoffe und Pufferbedingungen hinweg.
 

Biotherapeutika

Die Entwicklung von wirksamen und robusten Biotherapeutika ist ein komplexer Prozess. Lichtstreuung unterstützt diesen Prozess in jeder Phase mit einzigartigen, vielseitigen Technologien für biophysikalisches Screening und Charakterisierung. Von der Entdeckung der Targets und Kandidaten bis hin zur Auswahl, Optimierung, Reinigung, Formulierung und dem Scale-up der Herstellung.

Einige wichtige Anwendungen der Lichtstreuung für die Entwicklung von Biotherapeutika werden im Folgenden beschrieben.

Target & Kandidaten

Sobald Zielproteine und Kandidaten für eine bestimmte Indikation identifiziert sind, müssen sie in kleinem Maßstab in ausreichender Menge und in geeigneter Qualität für die weitere Forschung und Entwicklung hergestellt werden.

Lösliche Aggregate

Die Größenausschlusschromatographie mit Mehrwinkel-Lichtstreuung (SEC-MALS) charakterisiert Proteine und andere Biomoleküle präzise auf lösliche Aggregate, unabhängig von nicht-idealen Säuleninteraktionen, um schnell die optimalen Aufreinigungsbedingungen zu identifizieren.

Stabilität

High-Throughput Dynamische Lichtstreuung (DLS) mit dem DynaPro® Plate Reader erfordert minimale Probenmengen und wenig Zeit, um Kandidaten und Präparationsbedingungen auf Stabilität und Aggregationsneigung zu prüfen.

Wechselwirkungen

CG-MALS d.h. die Kopplung des Calypso® Composition-Gradient-Systems und einem DAWN® MALS Detektor, bestimmt die Affinität und die absolute Stöchiometrie der Wirkstoff-Target-Bindung ohne Marker und ohne Immobilisierung. CG-MALS eignet sich besonders gut für die Untersuchung multivalenter Wechselwirkungen oder der Wirkstoff-Target-Bindung in Gegenwart von Selbstassoziation, insbesondere für virusähnlicher Partikel (VLPs), monomere Antikörper, Oligonukleotide oder Peptide.

Auswahl von Kandidaten & Optimierung

Posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierung oder PEGylierung werden häufig an Proteinen oder Peptiden vorgenommen, um die Stabilität zu verbessern und die physiologische Verweildauer zu erhöhen. Einige Biologika, wie z. B. Insulin, müssen aus dem gleichen Grund wohldefinierte oligomere Zustände aufweisen. Die Modifikation von IgG mit konjugierten, hochtoxischen Medikamenten kann einen Antikörper in eine potente Anti-Krebs-Substanz verwandeln.

Wirkstoff-Antikörper-Verhältnis

Triple-detection SEC-MALS mit kombinierten UV-, MALS- und RI-Detektoren bestimmt den Grad der Glykosylierung bzw. PEGylierung und kann in vielen Fällen zur Berechnung des Wirkstoff-Antikörper-Verhältnisses (DAR) von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADCs) eingesetzt werden.

Oligomerisierung

CG-MALS analysiert die reversible Oligomerisierung durch Messung der Abhängigkeit der gewichtsmittleren molaren Masse von der Konzentration. Der oligomere Zustand kann eindeutig bestimmt werden, ebenso die Affinität.

Antikörper-Engineering und Modifikationen durch Mutationen an der genetischen Sequenz werden durchgeführt, um die Stabilität oder Wirksamkeit zu verbessern. SEC-MALS hilft, die Auswirkungen dieser Veränderungen auf die Aggregation zu bestimmen, während CG-MALS bewertet, wie diese die Bindungseigenschaften zum Zielmolekül verändern.

Biokolloide

Für größere Einheiten wie virusähnliche Partikel (VLPs) und polymer-, liposomen- oder hydrogelbasierte Wirkstoffträger ist die Trennung durch Feldflussfraktionierung (FFF) in der Regel der Größenausschlusschromatographie vorzuziehen. Das Eclipse FFF-System bietet eine Vielzahl von Optionen für eine optimale Trennung solcher Proben.

Prozessentwicklung

Lichtstreuung unterstützt Prozessentwicklung in mehrfacher Hinsicht:

Endpunkt der Aufreinigung

Da die Mehrwinkel-Lichtstreuung molare Massen unabhängig von der Retentionszeit bestimmt, ist RT-MALS ideal für die Echtzeit-Charakterisierung von Reinigungsprodukten sowie die Bestimmung der Endpunkte der Reinigung. Für eine detailliertere Produktcharakterisierung während der Prozessentwicklung kann SEC-MALS at-line mit UHPLC zur schnellen Trennung und Analytik eingesetzt werden.

Quartärstruktur

Komplexe Produkte wie virusähnliche Partikel (VLP) oder Peptidmizellen müssen mit spezifischen Massen, Formen und Größen sowie mit minimalen Mengen an freiem, nicht umgesetzten Material produziert werden. SEC-MALS und FFF-MALS mit On-line DLS können für die Validierung dieser Prozesse eingesetzt werden. So können nicht-assemblierte Untereinheiten quantifiziert werden um sicherzustellen, dass das Endprodukt der gewünschten Struktur entspricht.

Formulierung

Im Formulierungsprozess müssen die Proteine in vielen Kombinationen von verschiedenen Pufferbedingungenn und Hilfsstoffzusätzen auf Stabilität und Aggregationsneigung getestet werden. Die endgültige Auswahl der vielversprechendsten Bedingungen für die Langzeittests erfordert nicht notwendigerweise eine strenge thermodynamische Charakterisierung, sondern profitiert vom Verständnis verschiedener Eigenschaften, die Stabilität beschreiben. Die High-throughput DLS ist hierfür die ideale Technik, da sie mehrere stabilitätsbeschreibende Parameter gleichzeitig misst und mehrere tausende Bedingungen pro Tag testen kann:

Stabilitäts-Screening

  • Aggregationszustand - Ausbildung von Aggregaten, Größenverteilung und Kinetik des Aggregationsprozesses sind typische Anwendungen der DLS-Analyse.
  • Thermische Stabilität - Messung der Denaturierung und nicht-native Aggregation als Funktion der Temperatur. Die Änderung der Größe wird über Temperaturrampen gemessen.
  • Chemische Stabilität - Messung der Denaturierung und nicht-nativen Aggregation durch Pufferzusammensetzung (pH, Ionenstärke, denaturierende Substanzen wie Guanidin). Die Änderung der Größe wird bei verschiedenen Pufferzusammensetzungen gemessen.
  • Kolloidale Stabilität - Messung der Aggregation verursacht durch Oberflächeneffekte, wie beispielsweise geladene Gruppen oder hydrophobe Patches, unabhängig von einer Änderung der Tertiärstruktur. Bestimmt durch die Konzentrationsabhängigkeit des Diffusionskoeffizienten, kD oder D1.

Mit dem DynaPro Plate Reader finden diese Messungen in situ in Standard 96, 384 oder 1536 Mikrotiterplatten statt. Der Verbrauch an Probenmenge ist minimal. Die Proben können in denselben Platten in anderen plattenbasierten Instrumenten weiter analysiert werden, beispielsweise Analyse der Temperaturabhängigkeit der kolloidalen Stabilität im DynaPro Plate Reader und Analyse der intrinsischen Fluoreszenz in einem spektroskopischen Plate Reader. Das alles macht den DynaPro Plate Reader zu einem unschätzbaren Werkzeug für das Formulierungsscreening. Ein Softwarepaket ermöglicht die Integration des Geräts in robotergestützte Probenvorbereitung und Probenhandling.

Molekulare Ladung

Ein weiteres hilfreiches Lichtstreuwerkzeug für die Formulierung ist die elektrophoretische Lichtstreuung (ELS). Das Mobius kann mit einem Autosampler und dem Atlas zur automatischen Messung der molekularen Ladung, einem wichtigen Parameter für die Stabilität, kombiniert werden. Die Messung erfolgt in nativen Puffern, auch unter mittleren bis hohen Salzkonzentrationen. Wie der DynaPro Plate Reader bietet das Mobius die automatisierte Messung mehrerer Parameter, wie beispielsweise thermische und kolloidale Stabilität.

Hochkonzentrations-Formulierungen

Zusätzliche Herausforderungen bei der Charakterisierung hochkonzentrierter Formulierungen von monoklonalen Antikörpern und anderen Biotherapeutika stellen der Einfluss von schwachen Wechselwirkungen und die Auswirkung durch Veränderungen in der Viskosität dar.

Protein-Protein-Wechselwirkungen

Schwache Protein-Protein-Wechselwirkungen sind bei niedrigen Konzentrationen möglicherweise nicht wichtig und spiegeln sich daher nicht in den Parametern für Verdünnungsbedingungen wie kD, wider. Sie dominieren aber bei hohen Konzentrationen. CG-MALS berücksichtigt diese komplexen Wechselwirkungen in einzigartiger Weise durch einen theoretischen Rahmen, der als Minton-Chatelier-Formalismus bekannt ist. Diese Technik unterscheidet zwischen anziehenden Wechselwirkungen, die zu Aggregation und Viskosität führen, und abstoßenden Wechselwirkungen, die sich zwar auf die Messungen auswirken, aber wenig Einfluss auf die Stabilität haben.

Viskositäts-Screening

Die Viskosität ist sowohl ein Indikator für die kolloidale Stabilität als auch ein wichtiger Parameter für die Produktion und Zustellbarkeit des Endprodukts. Mit DLS lässt sich die Viskosität von konzentrierten Proteinlösungen unter Verwendung von Tracer-Beads leicht bestimmen. Der DynaPro Plate Reader kann die Viskosität von Proben in wenigen Sekunden bestimmen und so Tausende von Bedingungen pro Tag messen, um nach den idealen viskositätssenkenden Hilfsstoffen zu screenen. Hierfür genügen bereits 10 µL Probenvolumen.

Biophysikalische Charakterisierung

Lichtstreuung ist ein wesentlicher Bestandteil der biophysikalischen Charakterisierung von Biotherapeutika und wird von der FDA als Schlüsseltechnologie für Zulassungsanträge anerkannt. Zu den wichtigsten Anwendungen gehören:

Aggregation

Durch die Anwendung orthogonaler Techniken, die auf Lichtstreuung und anderen von Wyatt bereitgestellten Instrumenten basieren, können analytische Support-Labore Zulassungsanträge mit gründlich validierten, erweiterten Analysen von löslichen und unlöslichen Submikron-Aggregaten unterstützen. Diese Techniken sind

  • SEC-MALS für die robuste Charakterisierung der Molmassen- und Größenverteilungen von löslichen, irreversiblen Aggregaten
  • FFF-MALS zur robusten Charakterisierung der Molmassen- und Größenverteilungen von löslichen und unlöslichen, irreversiblen Aggregaten
  • Batch DLS zur schnellen Prüfung von Größenverteilungen für lösliche und unlösliche, reversible und irreversible Aggregate
  • CG-MALS zur Charakterisierung von reversiblen Aggregaten oder Oligomeren sowie zur Validierung von SEC-MALS bezüglich des Verlust von Aggregaten durch die Säule.

Konjugation

Triple-Detection mittels UV-MALS-dRI bestimmt die Zusammensetzung sowie Molmassenverteilungen von:

  • Protein-Polysaccharid-Impfstoffen
  • PEGylierten Proteinen/li>
  • Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten
  • Glykoproteinen
  • VLPs mit DNA/RNA-Beladung

Mit dem WyattQELS DLS Modul kann zusätzlich die Größenverteilung bestimmt werden.

  • Chemische Zusammensetzung: ELS bestimmt den Ladungszustand und ist damit ein wichtiger Indikator für die Oberflächenchemie.
  • Funktionalität: CG-MALS ist eine leistungsstarke Technik zur eingehenden Charakterisierung biomolekularer Wechselwirkungen, wie z. B. der Bindung zwischen Medikament und Zielmolekül, ohne Markierung oder Immobilisierung. Die molare Masse wird direkt gemessen, wodurch diese Technik besonders vielseitig für die Analyse von Valenzen und Selbst- sowie Heteroassoziationen ist.

Impfstoffe sind sehr vielfältig und reichen von traditionellen Impfstoffen, die auf abgeschwächten oder inaktivierten Viren basieren, bis hin zu den fortschrittlichsten auf Gentherapie basierenden Varianten. Die Instrumente von Wyatt Technology sind in allen Phasen der Impfstoffentwicklung unverzichtbar, von der grundlegenden Virologie über die Produktcharakterisierung bis hin zur Produktion und Qualitätskontrolle. Besuchen Sie die Webseite Lösungen zur Charakterisierung und Entwicklung von Impfstoffen für zusätzliche Informationen.

In den aktuellen Strategien zur Herstellung von Biotherapeutika wird durch eine strenge Kontrolle von Prozessparametern wie pH-Wert, Temperatur und Verbrauch von Ausgangsstoffen die Produktqualität sichergestellt. Erst am Ende des Prozesses können QC-Verfahren die kritischen Qualitätsattribute (CQAs) überprüfen, die die Produktqualität definieren. Daher überwachen die meisten PAT-Geräte eher die Prozessbedingungen als die Produktattribute.

OBSERVER"

Die Echtzeit-Mehrwinkel-Lichtstreuung (RT-MALS) ist eine neuartige PAT-Anwendung der Lichtstreuung, die direkt die Molmasse von mAbs und anderen therapeutischen Biomolekülen bestimmt. Sie ist besonders empfindlich gegenüber Aggregaten und kontaminierenden Partikeln. Durch den Einsatz des ultraDAWN™ RT-MALS-Instruments, in-line oder on-line innerhalb der Reinigung oder während anderer Prozessschritte, kann das Produktionspersonal die Prozessentwicklung beschleunigen, optimieren und erhält sofortiges Feedback über die Auswirkungen von Prozessvariationen und -abweichungen. Das ultraDAWN misst den durchschnittlichen Radius, für virusähnliche Partikel und andere biomolekulare Komplexe mit Durchmessern über 25-30 nm.

Nach der Optimierung des Prozesses kann das ultraDAWN online bleiben. Die zugehörige Software, OBSERVER, kann in die OPC-AU-Umgebung für den automatisierten und/oder GMP-Betrieb integriert werden. OBSERVER kann so programmiert werden, dass das System auf Abweichungen vom zulässigen Molmassenbereich aufgrund von Aggregation reagiert oder die Reaktion nach Erreichen des Endpunkts abschaltet.

Referenzen:

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