Die Grundlagen der Dynamischen Lichtstreuung

Batch-DLS kann Größenverteilungen und das Vorhandensein mehrerer Populationen in einer Probe bestimmen, ohne dass eine chromatografische Trennung erforderlich ist, was es zu einem ausgezeichneten Instrument für die schnelle Qualitätskontrolle und das Screening einer großen Anzahl von Proben im Hochdurchsatz macht. Solche Chargenmessungen von Proben mit einer R_h-Verteilung und einer entsprechenden Verteilung der Diffusionszeiten ergeben Autokorrelationsfunktionen, die durch die Summe der Autokorrelationsfunktionen aller Partikelspezies in der Probe, gewichtet mit ihren Lichtstreuintensitäten, beschrieben werden. Die Softwareprogramme DYNAMICS^®, DYNAMICS^® Touch^™ und ASTRA^® von Wyatt Technology enthalten zwei Methoden zur Gewinnung zusätzlicher Informationen aus Chargenmessungen solch komplexer Proben: Kumulantenanalyse und Regularisierungsanalyse (Abb. 4).

Die Kumulantenmethode geht von einer Partikelpopulation mit einem einzigen durchschnittlichen Diffusionskoeffizienten und einer einzigen Standardabweichung um diesen Durchschnitt aus. Der Algorithmus eignet sich für monomodale Proben, die monodispers oder polydispers sind (Abb. 4), wie etwa Nanopartikel oder Proteinproben mit Populationen von Monomeren, Dimeren und kleinen Oligomeren.

Bei der Regularisierungsmethode hingegen wird von einer beliebigen Anzahl von Partikelpopulationen ausgegangen, von denen jede ihren eigenen Diffusionskoeffizienten, ihre eigene Polydispersität und ihre eigene Standardabweichung hat. Die Regularisierung kann Spezies auflösen, die sich in ihrer Größe um mehr als das 3-5fache unterscheiden. Dies macht sie zur Methode der Wahl für die Identifizierung großer Aggregate und unlöslicher Spezies in Proteinproben.

Für jeden Peak oder jede Spezies liefert die Regularisierungsanalyse eine breite Palette von Parametern, darunter:

• ein Histogramm der Größenverteilung (Beispiele in der unteren Zeile von Tabelle 1)
• mittlerer Radius
• % Polydispersität
• die aus dem gemessenen Radius geschätzte molare Masse (M_w-R)
• die relative Lichtintensität, die von jeder Population gestreut wird (%Intensität), die geschätzte relative Menge an Masse (%Masse) oder die Anzahl der Partikel (%Anzahl).

Kumulanten- und Regularisierungsfits und ihre entsprechenden Abweichungen werden sofort nach der Datenerfassung in DYNAMICS und DYNAMICS Touch (Abb. 5) angezeigt, zusammen mit einer automatischen Bewertung der Datenqualität. So kann der Benutzer schnell feststellen, welche Messungen den Datenqualitätsstandards entsprechen, welche überprüft oder überarbeitet werden müssen und welche Methode die beste Anpassung liefert.

Unter Nutzung der Bestimmung der hydrodynamischen Größe aus dem Diffusionsverhalten und der gesamten Streuintensität kann eine weitere wichtige Eigenschaft gemessen werden: die Anzahl der Nanopartikel pro Volumeneinheit, N.

Für die Berechnung werden das Volumen V und der Brechungsindex n_Partikel, der Partikel sowie der Brechungsindex n₀ des Lösungsmittels benötigt. Die Annahme eines benutzerspezifischen Formmodells z. B. einheitliche Kugel oder beschichtete Kugel ist ebenfalls erforderlich. Dann kann der Diffusionskoeffizient interpretiert werden, um eine Dimension wie den Radius zu erhalten, aus dem das Volumen des Partikels berechnet wird (Abb. 6). Der Brechungsindex des Materials, aus dem die Partikel bestehen, kann in der Literatur nachgelesen werden. Die Partikelkonzentration pro Volumeneinheit, N, kann dann aus der Lichtstreuintensität, die als Überschuss-Rayleigh-Verhältnis bei Winkel Null quantifiziert wird und der folgenden Gleichung bestimmt werden (Van Holde, K. E. Physical biochemistry. Prentice-Hall, 1971):

Das maximale R_h für Konzentrationsmessungen beträgt 160 nm für den DynaPro Plate Reader und 175 nm für den DynaPro NanoStar. Partikel, die größer sind und komplexere Formen haben, erfordern eine Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS) und können mit dem Eclipse^™ FFF-MALS-System untersucht werden.

Unspezifische intermolekulare Wechselwirkungen sind in der Natur überall anzutreffen und haben vielfältige physikalische Ursachen wie elektrostatische Anziehung und Abstoßung, hydrophobe und ausgeschlossene Volumeneffekte sowie induzierte Dipole. Die Wechselwirkungen können anziehend oder abstoßend sein und sind für die Formulierung von Biotherapeutika von Interesse.

Sowohl der DynaPro NanoStar als auch der DynaPro Plate Reader können makromolekulare Wechselwirkungen mit DLS und/oder SLS quantifizieren. DLS bewertet unspezifische Wechselwirkungen und kolloidale Stabilität über den Diffusionswechselwirkungsparameter k_D. SLS quantifiziert den zweiten Virialkoeffizienten (A₂). Sowohl k_D als auch A₂ stellen komplementäre Messgrößen für die Wechselwirkung zwischen gelöster Substanz und Lösungsmittel in einem bestimmten Lösungsmittel dar und sind sowohl für das Verständnis von Wechselwirkungen als auch für die Einstufung von Formulierungen nützlich.

In einer ideal verdünnten Lösung ist der mit DLS gemessene Diffusionskoeffizient (D_t) nicht von der Konzentration des gelösten Stoffes abhängig. Mit zunehmender Konzentration wird die Lösung weniger ideal, und es wird eine Expansion erster Ordnung durchgeführt. Für den Diffusionsinteraktionsparameter k_D (in Einheiten von mL/g) ist die Korrektur erster Ordnung des Diffusionskoeffizienten wie folgt:

k_D wird durch Messung des Diffusionskoeffizienten als Funktion der Konzentration in dem Konzentrationsbereich bestimmt, in dem die Näherung erster Ordnung gilt (typischerweise 1 - 10 mg/mL).

Anziehende Wechselwirkungen (k_D < 0) führen zu einer scheinbaren Abnahme von D_t und einer scheinbaren Zunahme von R_h, während abstoßende Wechselwirkungen (k_D > 0) zu einer scheinbaren Zunahme von D_t und einer scheinbaren Abnahme von R_h führen (Abb. 7). Moleküle, die sich wie harte Kugeln verhalten und bei denen A₂ nahe am Wert des ausgeschlossenen Volumens liegt, haben typischerweise k_D-Werte zwischen 0 und 5 mL/g.

Der Diffusionswechselwirkungsparameter ist keine rein thermodynamische Größe, sondern kombiniert thermodynamische und hydrodynamische Beiträge. Für eine rein thermodynamische Größe, die kolloidale Wechselwirkungen beschreibt, wird üblicherweise der zweite Virialkoeffizient verwendet.

Der zweite Virialkoeffizient A₂, der mit SLS und MALS durch Messungen der Streuintensität in Abhängigkeit von der Konzentration ermittelt wird, gibt auch Auskunft über die lösungsmittelabhängige makromolekulare Selbstassoziation und kolloidale Stabilität. Insbesondere führen anziehende Wechselwirkungen (A₂ < 0) dazu, dass die Streuintensität überproportional ansteigt und zu einer scheinbaren Zunahme der molaren Masse führt, während abstoßende Wechselwirkungen (A₂ > 0) dazu führen, dass die Streuintensität unterproportional ansteigt und zu einer scheinbaren Abnahme der molaren Masse führt (Abb. 8). Bei niedrigen Konzentrationen, wie sie für die Chromatographie typisch sind, ist die Wirkung des A₂ vernachlässigbar, und er kann für die Datenanalyse auf 0 gesetzt werden.

In der DLS Analyse werden die zeitlichen Schwankungen der Streulichtintensität über eine Korrelationsfunktion zweiter Ordnung g⁽²⁾ (τ) quantifiziert. Die Funktion der Intensität wird um eine Verzögerungszeit (τ) verschoben und die Autokorrelationsfunktion g(τ) berechnet. Qualitativ gesehen ist die Autokorrelationsfunktion ein Maß dafür, wie ähnlich die Intensitätsfunktion sich selbst ist, wenn sie um die Zeit τ verschoben wird. Wenn der Wert von τ zunimmt, erreicht die Funktion eine Basislinie von 1.

Genauer gesagt, und wie in verschiedenen Texten über Lichtstreuung beschrieben (vgl. Chu, B. Laser Light Scattering: Basic Principles and Practice; Academic Press: Boston, 1991), kann die Korrelationsfunktion für eine monodisperse Probe durch die folgende Gleichung analysiert werden:

wobei β die Amplitude der Korrelationsfunktion bei einer Verzögerung von Null ist, Γ die Abklingrate ist und die Basislinie der Korrelationsfunktion bei unendlicher Verzögerung auf den Wert 1 zurückgeht.

DYNAMICS und ASTRA verwenden einen nichtlinearen Algorithmus zur Anpassung der gemessenen Korrelationsfunktion an Gleichung 2, um die Abklingrate der Korrelationsfunktion Γ zu ermitteln. Von diesem Punkt aus kann Γ über die folgende Beziehung in den Translationsdiffusionskoeffizienten D_t für das Teilchen umgewandelt werden:

Hier ist q die Größe des Streuvektors und wird beschrieben durch:

wobei n₀ der Brechungsindex des Lösungsmittels, Λ die Vakuumwellenlänge des einfallenden Lichts und q der Streuwinkel ist.

Schließlich kann der Diffusionskoeffizient über die Stokes-Einstein-Gleichung als der hydrodynamische Radius R_h einer diffundierenden Kugel interpretiert werden:

wobei k die Boltzmann-Konstante, T die Temperatur in K und h die Viskosität des Lösungsmittels ist (Abb. 3).