Die Lichtstreuung ermittelt die Verzweigung in Polymeren und andere Parameter, die die Form oder Struktur im Submikrometerbereich beschreiben, vollständig in Lösung.
 

Konformation

Kleiner als die Wellenlänge des sichtbaren Lichts, ist es notorisch schwierig, die Form, Struktur oder Konformation von Makromolekülen und Nanopartikeln zu bestimmen. Während bildgebende Verfahren wie AFM und cryoTEM in einigen Fällen detaillierte Informationen liefern können, erfordern sie erhebliche Änderungen der nativen Lösungsbedingungen (Ablagerung auf einer Oberfläche) und messen ein sehr kleines, oft nicht repräsentatives Ensemble. Lichtstreuung bietet eine nicht-invasive Bestimmung der Konformation, in Lösung, über große und repräsentative Ensembles.

Die Verwendung der Dreifach-Detektions-GPC bestehend aus Statische Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS), differentielle Viskosimetrie (dVI) oder Dynamische Lichtstreuung (DLS) und differentielle Refraktometrie (dRI), ermöglicht unabhängig oder in Kombination eine quantitative Analyse. Sie wird unter anderen angewendet um:

  • Das Verzweigungsverhältnis in Polymeren und Dendriten zu bestimmen
  • Die Form von Proteinaggregaten oder Amyloidfibrillen zu untersuchen
  • Leere oder gefüllte Träger-Nanopartikel zu unterscheiden

Verzweigungsverhältnis

Conformation

Wichtige Eigenschaften synthetischer Polymere wie Steifheit, Viskosität und Löslichkeit werden durch das Verzweigungsverhältnis g bestimmt. Wie in dem White Paper 'Branching Revealed: Characterizing Molecular Structure in Synthetic and Natural Polymers by Multi-Angle Light Scattering' von Dr. Stepan Podzimek beschrieben, wird das Verzweigungsverhältnis am zuverlässigsten aus der Steigung v des log-log-Plots des rms-Radius Rg gegen die molare Masse Mw bestimmt. Da MALS beide Parameter - gleichzeitig und unabhängig - nach einer größenbasierten Trenntechnik wie SEC oder FFF bestimmt, ist es die ideale Technik für diesen Zweck, solange die Moleküle größer als etwa 10 nm im Radius sind.

Branched Polymer

 

Bei kleineren Molekülen kann Rg durch den hydrodynamischen Radius Rh ersetzt werden, der durch Differenzialviskosimetrie oder Online-DLS bestimmt wird. Wird ein ViscoStar®-Differenzviskosimeters zusätzlich zu einem MALS-System angeschlossen, kann durch die zusätzliche Information der intrinsischen Viskosität die Mark-Houwink-Parameter des Makromoleküls bestimmt werden und damit auch Aussagen über seine Gestalt getroffen werden.  

Formfaktor

Für makromolekulare Baugruppen, außer verzweigten Polymeren, ist die log-log-Darstellung von Rg gegen Mw ein Indikator für die Form. Mit zunehmender Steigung v werden die Konformationen von kugelförmigen, über zufälligen Windungen bis hin zu linearen Polymeren beschrieben. Beispielsweise werden amorphe Proteinaggregate von Amyloidfibrillen durch den Wert von v unterschieden, der bei amorphen Aggregaten im Bereich von sphärisch bis statistisches Knäuel bzw. Random-Coil liegt. Bei Amyloidfibrillen ist er jedoch viel näher an dem für eine lineare Anordnung erwarteten Wert.

Ähnliche Informationen erhält man aus dem Formfaktor, ρ = Rg/Rh, für jede makromolekulare Größenfraktion. Der theoretische Formfaktor von Ellipsoiden, die oft zur Darstellung von Makromolekülen und deren Assemblierungen oder bei Aggregaten herangezogen werden, ist als Funktion des Halbachsenverhältnisses bekannt. Daher ist MALS mit gleichzeitiger, integrierter DLS mittels des WyattQELS Moduls eine unabhängige und orthogonale Methode zur Bestätigung der Form eines Makromoleküls oder eines Nanopartikels.

Wenn bekannt ist, dass der Analyt eine bestimmte Form hat, liefert der Formfaktor Strukturinformationen. Da z. B. Liposomen immer kugelförmig sind, unterscheidet der Formfaktor ρ eindeutig zwischen leeren Liposomen und solchen, die mit einer Substanz wie z.B. einem Wirkstoff gefüllt sind.

Conformation of Liposomes

ρ = ~1.00

ρ = ~0.77

Instrumente für Konformationsanalyse

MALS Detektoren

 dawn, molar mass determination, molar mass measurement, molar mass analysis, molecular weight measurement, molar mass characterization

DAWN® - Der sensitivste MALS-Detektor, der auf dem Markt erhältlich ist. Beinhaltet Detektoren in 18 Winkeln zur Bestimmung der molaren Massen im Bereich von 200 Da bis 1 GDa und Radien von 10 - 500 nm.

  • Standardoption: Umgebungstemperatur
  • Option Heizen/Kühlen: -15 °C bis +150 °C
  • Hochtemperatur-Option: Umgebungstemperatur bis +210 °C

Das DAWN bietet spezielle Optionen für die Handhabung fluoreszierender Proben wie Fluoreszenzfilter und einen Infrarot-Laser mit 785 nm.


miniDAWN®
- In der Empfindlichkeit nur vom DAWN übertroffen. Beinhaltet Detektoren in 3 Winkeln zur Bestimmung der molaren Massen im Bereich von 200 Da bis 10 MDa und Radien von 10 - 50 nm bzw. 150 nm, mit speziellen Streufunktionen. Nicht temperiert.

microDAWN® - Der erste MALS-Detektor für UHPLC, mit einer Interdetektor-Dispersion von nur 1,5 µL. Beinhaltet Detektoren in 3 Winkeln zur Bestimmung der molaren Massen im Bereich von 200 Da bis 20 MDa und Radien von 10 - 50 nm. Nicht temperiert.

Viskosimeter

ViscoStar

ViscoStar® - Ein hochempfindliches Online-Differenzviskosimeter, das in Verbindung mit SEC-MALS zur Bestimmung der Größe und Konformation aller Arten von Biopolymeren, synthetischen Polymeren und sogar Proteinen und Peptiden verwendet wird.

Das ViscoStar beinhaltet mehrere neuartige Technologien, um die höchste Empfindlichkeit, Stabilität und Lösungsmittelkompatibilität aller verfügbaren Viskosimeter für die GPC zu bieten. Seine Benutzer- und Wartungsfreundlichkeit machen ihn zur perfekten Ergänzung für die Lichtstreu- und Brechungsindexdetektoren DAWN® und Optilab® von Wyatt. Temperaturgesteuert von 4 °C bis 70 °C.

microViscoStar® - Ähnlich wie der ViscoStar, aber speziell für die Verwendung mit UHPLC/APC entwickelt.

Brechungsindex-Detektor

Optilab® - Ein einzigartiges Online-Differenzialrefraktometer zur Konzentrationsmessung beliebiger Makromoleküle, unabhängig von Chromophoren. Das Hochkonzentrations-Optilab kann Proteinkonzentrationen bis zu 180 mg/mL analysieren.

microOptilab - Der erste RI-Detektor, der speziell für die Verwendung mit allen UHPLC-Systemen entwickelt wurde.

Feldflussfraktionierungssysteme

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Die Feldflussfraktionierung führt vielseitige Trennungen von Makromolekülen und Nanopartikeln im Bereich von 1 bis 1000 nm im Radius und darüber hinaus durch. FFF-MALS-DLS ist das ideale Mittel, um Verteilungen von molarer Masse und Größe, Nanopartikelkonzentration und erweiterte Charakterisierung von Konformation und Konjugatgehalt zu erhalten.

Eclipse - Ein FFF-Gerät mit überlegener Leistung, Zuverlässigkeit und Benutzerfreundlichkeit. Unterstützt das Dilution Control Module für erhöhte Empfindlichkeit und die SEC-Umschaltoption zur Nutzung des Systems im FFF- oder SEC-Trennmodus.

Mobility EAF4-System - Ein Zusatzmodul für eine Eclipse, das eine FFF mit elektrischen/asymmetrischen Fluss zur Bestimmung von Ladungs- und Zetapotentialverteilungen durchführt.

Eclipse-Kanäle - Die Eclipse bietet eine große Auswahl an Trennkanälen und Membranen für eine Vielzahl von analytischen und sogar semipräparativen Aufgaben.

Dynamische Lichtstreudetektoren

DynaPro NanoStar

WyattQELS - Ein Modul für Dynamische Lichtstreuung (DLS), das in einen DAWN-, miniDAWN- oder microDAWN-MALS-Detektor integriert werden kann, um gleichzeitige DLS-Messungen im selben Streuvolumen zu ermöglichen.

DynaPro® NanoStar® - Mit einem Probenvolumen von nur 1,25 µL und einer Temperaturkontrolle von -15 °C bis +150 °C geht der NanoStar über die traditionellen küvettenbasierten DLS-Instrumente hinaus: Er bietet einen optimierten Statischen Lichtstreudetektor parallel zum DLS-Detektionssystem, der zur schnellen Beurteilung der Konformation und Probenreinheit verwendet werden kann. Das NanoStar erfüllt eine Doppelfunktion als Online-DLS-Detektor, indem seine optische Faser mit einen Wyatt-MALS-Detektor gekoppelt werden kann.

Software

ASTRA® - Unsere umfassende Softwarelösung für die MALS-Analyse im Chromatographie-, FFF- oder Batch-Modus. ASTRA ist in einer 21CFR(11)-konformen Version erhältlich und bietet zusätzliche Optionen wie die Partikelanalyse

DYNAMICS® - Software für Batch-DLS-Messungen in den DynaPro Instrumenten, sowie Bestimmung molerer Masse und A2 im NanoStar und DynaPro Plate Reader. Berechnet Größe und Größenverteilungen und bestimmt Parameter wie die Schmelztemperatur Tm, die Aggregationstemperatur Tagg und den Diffusionsinteraktionsparameter kD. Berechnet das Achsenverhältnis basierend auf dem Diffusionskoeffizienten, dem spezifischen Volumen und der molaren Masse.