Wie man das Molekulargewicht bestimmt
Es gibt zwar viele Möglichkeiten, die molare Masse oder Molekulargewichte von Makromolekülen wie Proteinen, Biopolymeren und synthetischen Polymeren zu bestimmen, aber nur eine bestimmt schnell und effektiv die absoluten Molekulargewichte in Lösung: Multi-Angle Light Scattering (MALS). MALS kombiniert die präzisen Messungen von Lichtstreusintensität und Konzentrationsmessungen für eine rigorose Berechnung der Molekulargewichte in Lösung - ohne Annahmen über Konformation bzw. Form und ohne Beeinträchtigung der Probe. Die Theorie der Mehrwinkel-Lichtstreuung für die Bestimmung von molaren Massen wird in der Theorie der klassischen Lichtstreuung ausführlich beschrieben.
Während die Säulenkalibrierung nahelegen würde, dass Hämoglobin viel kleiner als BSA ist, zeigt MALS, dass diese Proteine tatsächlich ähnliche molare Massen besitzen. Die Polydispersität von Hämoglobin, hier zu sehen als nachlaufende Schulter mit abnehmendem Molekulargewicht, ist auf ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Monomeren, Dimeren und Tetrameren zurückzuführen.
MALS gekoppelt an eine Trenntechnik
MALS-Detektoren werden am häufigsten mit einer Trenntechnik wie der Größenausschlusschromatographie (SEC-MALS) oder der Feldflussfraktionierung (FFF-MALS) kombiniert. Durch die Integration einer unabhängigen, absoluten MALS-Analyse wird die Abhängigkeit von unzuverlässigen Säulenkalibrierungen, Retentionszeiten und Modellen der hydrodynamischen Größe gegenüber der molaren Masse beseitigt, um genaue Molmassenverteilungen über das Chromatogramm oder Fraktogramm zu erhalten.
Wichtige Anwendungen von SEC-MALS und FFF-MALS
- Molmassenverteilungen von heterogenen Proben wie Kohlenhydraten oder synthetischen Polymeren
- Genaue Aggregations- und Oligomerisierungszustände von Proteinen, Peptiden und virusähnlichen Partikeln (VLPs)
- Stöchiometrie von Protein-Heterokomplexen
Auf den Seiten SEC-MALS und FFF-MALS erfahren Sie, wie diese vielseitigen Techniken mehrere Detektoren, darunter die MALS-Detektoren DAWN®, miniDAWN® oder microDAWN® und die Brechungsindex-Konzentrationsdetektoren Optilab® oder microOptilab™ mit der ASTRA®-Software kombinieren, um eine Fülle von Informationen über Ihre Proben jenseits der molaren Masse zu gewinnen.
MALS ohne vorherige Trennung
Auch wenn die Proben nicht mit einer Trenntechnik kompatibel sind, kann MALS zur Analyse der molaren Masse verwendet werden. Die Analyse von unfraktionierten Proben liefert das gewichtsmittlere Molekulargewicht Mw der Lösung sowie den zweiten Virialkoeffizienten A2 (auch bekannt als B22), ein Maß für die Wechselwirkungen zwischen Lösung und Lösungsmittel.
Diese unfraktionierten Messungen bzw. „Batch“-Messungen werden typischerweise durch direkte Injektion in eine MALS-Durchflusszelle durchgeführt. Für maximale Genauigkeit wird die Messung über mehrere Konzentrationen durchgeführt. In der Vergangenheit waren Batch-Messungen mühsam und anfällig für Bedienerfehler; das Calypso® automatisiert Batch-MALS für genaue, zuverlässige und schnelle Ergebnisse.
Wenn die Verwendung einer Durchflusszelle nicht erwünscht ist, bietet Wyatt ein microCuvette Adapter Kit an, das die Durchflusszelle eines DAWN durch eine hochwertige Mikroküvette mit geringem Volumen ersetzt. Alternativ bietet das DynaPro® NanoStar® eine echte Statische Lichtstreuanalyse (SLS) der molaren Masse für Moleküle < 50 nm Radius.
Batch-MALS ist auch als orthogonale Technik nützlich, um SEC-MALS-Ergebnisse gegen möglichen Probenverlust auf der Säule sowie Dissoziation von Aggregaten aufgrund von Scherung oder Verdünnung zu validieren.
Molmassenbestimmung über Dynamische Lichtstreuung (DLS)
Streng genommen misst DLS die Diffusionskonstante von Partikeln in Lösung und kann die molare Masse nicht direkt und absolut bestimmen. Die DLS-Analyse schätzt die molare Masse in der DYNAMICS-Software, indem sie die Diffusionskonstante in eine effektive Größe umrechnet und Modelle verwendet, die Beziehungen zwischen Größe und Masse annehmen. Siehe DLS-Theorie für weitere Details.
DLS ist fürschnelles Screening kleiner Volumina geeignet, um Aggregation und andere Verschiebungen der Lösungseigenschaften effektiv zu bestimmen. Probenvolumina von nur 1,25 µL können mit dem DynaPro NanoStar analysiert werden, während der DynaPro Plate Reader Hochdurchsatzmessungen in Standard-Mikrotiterplatten ermöglicht.
Molmassenbestimmung über Intrinsische Viskosität
Intrinsische Viskosität und „Universelle Kalibrierung“ werden üblicherweise zur Bestimmung des Molekulargewichts von synthetischen Polymeren verwendet. Obwohl diese Techniken weniger zuverlässig sind als MALS, können sie das optimale Mittel zur Charakterisierung von Materialien sein, die sich nicht für die MALS-Analyse eignen:
- Wenn das Lösungsmittel und der gelöste Stoff die gleichen Brechungsindizes haben (so dass dn/dc=0), streut das Polymer kein Licht
- Wenn die Polymere unter der Anregung durch den MALS-Laser fluoreszieren, erhöht die Fluoreszenz das scheinbare Lichtstreusignal erheblich und führt zu falschen Molekulargewichten. Obwohl ein Fluoreszenzsperrfilter in das DAWN eingebaut werden kann, ist dies bei stark fluoreszierenden Polymeren nicht immer ausreichend.
Das ViscoStar-Differenzialviskosimeter, das mit einem Optilab-Differenzialrefraktometer an ein beliebiges GPC-System gekoppelt werden kann, liefert hervorragende Messungen der intrinsischen Viskosität zur Charakterisierung aller Arten von Polymeren. Die Schätzung der molaren Massen auf Basis der intrinsischen Viskosität und der Mark-Houwink-Gleichung η=KMα basiert auf empirischen Werten für K und α, die in der Literatur festgehalten sind, während die universelle Kalibrierung für alle Random Coil Polymere gültig ist, solange keine nicht-idealen Säulenwechselwirkungen vorhandenwerden sind.
Die ASTRA-Software analysiert nicht nur Polymere auf der Grundlage der Mark-Houwink-Gleichung und der universellen Kalibrierung, sondern kann auch verwendet werden, um Mark-Houwink-Koeffizienten und molare Massen ab initio mithilfe von Lichtstreuung zu bestimmen.
MALS in der Prozesskontrolle
Zusätzlich zu den analytischen Standardanwendungen von MALS kann es zur Entwicklung, Überwachung und Steuerung von Herstellungsprozessen eingesetzt werden, direkt in der Pilotanlage oder in der Fertigung. Das ultraDAWN™ zusammen mit der OBSERVER™-Software bestimmt und dokumentiert die gewichtsgemittelte molare Masse von Protein- oder Polymerlösungen, die das Gerät durchlaufen, in Echtzeit; dies wird als RT-MALS bezeichnet.
Application Notes
Referenzen
Folta-Stogniew, E. J. Macromolecular Interactions: Light Scattering. In Encyclopedia of Life Sciences; Wiley: 2001.
Lu, D.; Jimenez, X.; Zhang, H.; Atkins, A.; Brennan, L.; Balderes, P.; Bohlen, P.; Witte, L.; Zhu, Z. Di-diabody: a novel tetravalent bispecific antibody molecule by design. J. Immunol. Methods 2003, 279, 219-232.
Mogridge, J. Using light scattering to determine the stoichiometry of protein complexes. In Protein-Protein Interactions: Methods in Molecular Biology; Fu, H., Ed.; Humana Press: New York, 2004; Vol. 261, p 113-118.
Waters, J.; Leiske, D. Characterization of hyaluronic acid with on-line differential viscometry, multi-angle light scattering, and differential refractometry. LCGC 2005, 23, 302-310.
Instrumente für die Messung der molaren Masse
MALS Detektoren
DAWN® - Der empfindlichste MALS-Detektor, der auf dem Markt erhältlich ist. Beinhaltet Detektoren in 18 Winkeln zur Bestimmung von molaren Massen von 200 Da bis 1 GDa und Radien von 10 - 500 nm.
- Standardoption: nicht temperiert
- Beheizte/gekühlte Option: -15 °C bis +150 °C
- Hochtemperatur-Option: Umgebungstemperatur bis +210 °C
Das DAWN bietet spezielle Optionen zur Messung fluoreszierender Proben: Fluoreszenzsperrfilter und einen Infrarot-Laser mit 785 nm.
miniDAWN® - Die zweithöchste Empfindlichkeit nach dem DAWN. Beinhaltet Detektoren in 3 Winkeln zur Bestimmung von molaren Massen von 200 Da bis 10 MDa und Radien von 10 - 50 nm. Nicht temperiert.
microDAWN® - Der erste MALS-Detektor für die UHPLC, mit einer Interdetektor-Dispersion von nur 1,5 µL. Beinhaltet Detektoren in 3 Winkeln zur Bestimmung von molaren Massen von 200 Da bis 20 MDa und Radien von 10 - 50 nm. Nicht temperiert.
Brechungsindex-Detektoren
Optilab® - Ein einzigartiges Online-Differenzialrefraktometer zur Konzentrationsmessung beliebiger Makromoleküle, unabhängig von Chromophoren. Temperaturgesteuert von 4 °C bis 65 °C. Die Hochkonzentrationsoption ermöglicht die Bestimmung von Proteinkonzentrationen bis zu 180 mg/mL.
microOptilab™ - Der erste RI-Detektor, der speziell für die Verwendung mit UHPLC-Systemen entwickelt wurde.
Viskosimeter
ViscoStar® - Ein hochempfindliches Online-Differenzialviskosimeter, das in Verbindung mit SEC-MALS zur Bestimmung der Größe und Konformation aller Arten von Biopolymeren, synthetischen Polymeren und sogar Proteinen und Peptiden eingesetzt wird.
Das ViscoStar beinhaltet verschiedene Technologien, um die höchste Empfindlichkeit, Stabilität und Lösungsmittelkompatibilität aller verfügbaren Viskosimeter für die GPC zu bieten. Seine Benutzer- und Wartungsfreundlichkeit machen ihn zur perfekten Ergänzung für die Lichtstreuungs- und Brechungsindexdetektoren DAWN® und Optilab® von Wyatt. Temperaturgesteuert von 4 °C bis 70 °C.
microViscoStar® - Ähnlich wie das ViscoStar, jedoch speziell für den Einsatz mit UHPLC/APC entwickelt.
Feldflussfraktionierungssysteme
Die Feldflussfraktionierung führt vielseitige Trennungen von Makromolekülen und Nanopartikeln im Bereich von 1 bis 1000 nm Durchmesser und darüber hinaus durch. FFF-MALS-DLS ist das ideale Mittel, um Verteilungen von molarer Masse und Größe, die Konzentration von Nanopartikeln und eine erweiterte Charakterisierung von Konformation und Konjugatgehalt zu erhalten.
Eclipse™ - FFF-Gerät mit überragender Leistung, Zuverlässigkeit und Benutzerfreundlichkeit. Unterstützt das Dilution Control Module™ für verbesserte Empfindlichkeit und die SEC-Umschaltoption für die Nutzung des Systems im FFF- oder SEC-Trennungsmodus.
Mobility™ EAF4-System - Add-on zu einer Eclipse, das eine FFF mit elektrischen/asymmetrischen Fluss zur Bestimmung von Ladungs- und Zetapotentialverteilungen durchführt.
Eclipse-Kanäle - Die Eclipse bietet eine große Auswahl an Trennkanälen und Membranen, um eine Vielzahl von analytischen und sogar semipräparativen Aufgaben zu erfüllen.
Instrumente für Batch-Messungen
DynaPro® Plate Reader - Das einzige kommerziell erhältliche Gerät, das DLS und SLS für Größe und molare Masse direkt in situ in Standard 96, 384 oder 1536 Mikrotiterplatten misst. Der störungsfreie DynaProPlate Reader ist mit Robotersystemen kombinierbar und bietet dadurch multi-platten-basierten Assay-Protokolle. Temperaturgesteuert von 4 °C bis 85 °C.
DynaPro® NanoStar® II - Mit einem Probenvolumen von nur 2 µL und einer Temperaturregelung von -10 °C bis +120 °C geht der NanoStar weit über herkömmliche küvettenbasierte DLS-Geräte hinaus. Er bietet einen optimierten Statischen Lichtstreudetektor parallel zum DLS-Detektionssystem, um die absolute molare Masse zu bestimmen.
Calypso® - Präparations- und Probenzuführungssystem für die Durchführung und Analyse von automatisiertem Batch (unfraktionierten) MALS zusammen mit einem DAWN oder miniDAWN.
microCuvette - Ermöglicht die gleichzeitige Durchführung von Statischen und Dynamischen Lichtstreumessungen in einem DAWN-Detektor unter Verwendung einer Quarzküvette, die nur 10 µL benötigt.
Microbatch-Kit - Wird zur Injektion von Proben in die Durchflusszelle eines MALS-Detektors und zur Bestimmung von dn/dc verwendet.
Software
ASTRA® - Unsere umfassende Softwarelösung für die MALS- und DLS-Analyse im Chromatographie-, AF4- oder Batch-Modus. ASTRA ist in einer 21CFR(11)-konformen Version erhältlich und bietet zusätzliche Optionen wie die Partikelanalyse.
DYNAMICS® - Software für Batch-DLS-Messungen in den DynaPro- und Mobius™-Geräten, sowie Bestimmung der molaren Masse und A2 im NanoStar und DynaPro Plate Reader III und der elektrophoretischen Mobilität im Mobius. Berechnet Größe und Größenverteilungen und bestimmt Parameter wie die Schmelztemperatur Tm, die Aggregationstemperatur Taggund den Diffusionsinteraktionsparameterer kD.
CALYPSO™ - Die CALYPSO-Software steuert das Calypso-Zusammensetzungsgradientensystem und einen MALS-Detektor zur Messung des gewichtsmittleren Molekulargewichts der Lösung als Funktion der Konzentration oder der Pufferbedingungen. Diese Messungen werden von der CALYPSO-Software weiter analysiert, um Bindungskonstanten, absolute Stöchiometrie und andere Parameter der makromolekularen Wechselwirkungen zu bestimmen.
VISION™ - Steuert das Eclipse Feldflussfraktionierungs (FFF)-System. Gekoppelt mit ASTRA zur Datenerfassung und -analyse bietet VISION dem Anwender eine Komplettlösung für die makromolekulare Charakterisierung.