Konjugation & Beladungsgrad-Analyse

Viele interessante und nützliche Makromoleküle bestehen aus zwei chemisch und physikalisch unterschiedlichen Spezies, die kovalent verbunden sind. Dies kann es recht schwierig machen, die wesentlichen Eigenschaften molarer Masse und Größe zu charakterisieren.

Die Kombination von DAWN^® Mehrwinkel-Lichtstreu-Detektor (MALS) mit einem UV- und Optilab^® Brechungsindex-Detektor (dRI) mit Größenausschlusschromatographie sowie der ASTRA Konjugatanalyse bietet die Lösung für die Charakterisierung konjugierter Makromoleküle. Dieser Aufbau kann zur Analyse des Konjugationsverhältnisses oder des Beladungsgrades sowie der Größenverteilungen, der Verkapselungseffizienz, der Form, der Konformation oder der Polymerverzweigung verwendet werden. Die Bestimmung der Parameter der einzelnen Komponenten und deren Abhängigkeit von der Größe kann für Arzneimittel, Impfstoffe und Gentherapien besonders wichtig sein.

Die herkömmliche analytische Größenausschlusschromatographie (SEC) reicht nicht aus, um Konjugate zu charakterisieren, da es keine Kalibrierstandards gibt, die das Elutionsverhalten des spezifischen Konjugats widerspiegeln. Die Kombination von MALS, UV- und dRI-Detektion mit SEC sowie dem ASTRA Algorithmus zur Konjugatanalyse bietet die Lösung für die Charakterisierung von Makromolekülen wie z. B.:

• Glykoproteine, Lipoproteine und Nanodiscs
• Protein-Polysaccharid-Impfstoffe
• Block-Copolymere
• PEGylierte Proteine
• Protein-Nukleinsäure-Komplexe
• In Detergenzmizellen solubilisierte Membranproteine

Funktionsprinzip

Konzeptionell kann ein Komplex, der aus einem Protein, das UV-aktiv ist und einem Modifikator wie Polyethylenglykol oder PEG, das keinen UV-Chromophor enthält, besteht, durch die Kombination von Informationen aus zwei verschiedenen Messungen analysiert werden. Die UV-Absorption bestimmt die Proteinkonzentration, während der RI die Gesamtkonzentration des Makromoleküls bestimmt. Diese beiden Messungen sind ausreichend, um das Verhältnis von Protein und Modifikator im Komplex zu bestimmen (dies trifft auch zu, wenn beide Komponenten UV-Licht absorbieren, solange die Extinktinktionskoeffizienten ausreichend verschieden sind).

Diese Analyse kann jedoch nicht die Gesamtmasse oder den oligomeren Zustand der Spezies bestimmen. Die Integration von MALS ermöglicht jedoch die vollständige Charakterisierung der Konjugate. Da die Lichtstreuung proportional zum Produkt aus molarer Masse und Konzentration ist, reicht die Kombination dieser drei Signale aus, um nicht nur das Verhältnis, sondern die tatsächliche molare Masse und damit den oligomeren Zustand jeder Komponente zu bestimmen. Diese Information ist entscheidend für die Beurteilung der Aggregation von Glykoproteinen, die Bestimmung der molekularen Konformation konjugierter Polysaccharide, die Messung der molaren Masse von Block-Copolymeren oder die Entscheidung, ob ein durch Detergenzien solubilisiertes Membranprotein als natives Oligomer vorliegt oder nicht.

Adeno-assoziierte Viren und kleine, unbehüllte virusähnliche Partikel sind Sonderfälle der Standard-Konjugatanalyse. Ihre strukturellen Komponenten sind in der Regel sehr gut definiert in Bezug auf die Gesamtmolmasse der Proteine, die das Kapsid bilden und die genomische Beladung. Die SEC-MALS-UV-dRI-Methode bestimmt das Molekulargewicht der Kapside und das durchschnittliche Molekulargewicht der Beladung, woraus sich der Anteil der leeren und gefüllten Kapside berechnen lässt - auch wenn sie in der SEC zusammen eluieren. Bei Kenntnis der Extinktionskoeffizenten bei 260 nm und 280 nm, kann die gleiche Analyse in Kombination mit MALS durchgeführt werden.

Funktionsprinzip

Die ASTRA-Virusvektoranalyse erweitert die standardmäßige Konjugatanalyse, um nicht nur die molare Masse der Protein- und Nukleinsäurekomponenten zu bestimmen, sondern auch Vg/Cp, das Verhältnis der vollen Genome zu der gesamten Kapsidmenge. Des Weiteren kann die Gesamtkonzentration der leeren und vollen Kapside sowie deren Summe bestimmt werden. Außerdem wird der Aggregatanteil quantifiziert, so dass insgesamt drei kritische Qualitätsattribute (CQA) in einem einzigen Lauf quantifiziert werden.

Da die SEC-MALS-Methode unabhängig vom AAV-Serotyp ist, keine speziellen Reagenzien oder Prozeduren erfordert und mit Standard-HPLC-Instrumenten automatisiert werden kann, eignet sie sich als Plattformmethode für verschiedene AAV-Produkte und alle Phasen der Entwicklung, Herstellung und Qualitätskontrolle. Wyatt bietet eine umfassende Anleitung zur Entwicklung von Standardarbeitsanweisungen (SOP) für die AAV-Analyse mit SEC-MALS. Erfahren Sie mehr über die Charakterisierung von Genvektoren und die AAV-Servicepakete von Wyatt.

Zusammengesetzte Nanopartikel bestehen im Allgemeinen aus einem Strukturmolekül und der Beladung. Wie bei konjugierten Makromolekülen ist die MALS-UV-dRI-Detektion mit einer Trenntechnik wie SEC oder Feldflussfraktionierung (FFF) eine wesentliche Methode zur Charakterisierung der Größe und Zusammensetzung solcher binären zusammengesetzten Nanopartikel. Aufgrund ihrer Größe ist die Analyse von Nanopartikeln mit diesem Verfahren jedoch mit Herausforderungen verbunden, die durch ASTRAs neuartigen Algorithmus zur Analyse von Nanokonjugaten überwunden wird. Zu den Produkten, die in diesen Größenbereich fallen - und für die Nanokonjugat-Analyse geeignet sind - gehören:

• Lipid-Nanopartikel (LNP), die RNA- oder DNA-Nutzlasten einkapseln
• Liposomen oder PLGA-Polyplexe, die kleine Wirkstoffe oder Peptide als Nutzlast enthalten
• Protein-Polysaccharid-Impfstoffe im Molmassenbereich von mehreren Megadalton

Funktionsprinzip

Die Konjugatanalyse beruht auf genauen UV-Messungen. Wenn der Radius des Partikels oder großen Makromoleküls über etwa 20 nm liegt, wird die Streuung des einfallenden UV-Lichts durch den Analyten selbst erheblich. Dies führt dazu, dass der Detektor ein UV-Extinktionssignal anzeigt, obwohl möglicherweise keine Absorption vorliegt. Ein leeres Liposom zum Beispiel absorbiert bei 260 nm kein UV-Licht, erzeugt aber aufgrund der Streuung ein nennenswertes UV-Signal. Eine unkorrigierte Verwendung dieser UV-Daten auf die Standard-Konjugatanalyse führt zu fehlerhaften Ergebnissen.

Die Nanokonjugat-Analyse charakterisiert das Signal des UV-Detektors durch die Streuung leerer Lipidpartikel oder nicht konjugierter Polysaccharide über einen Molmassenbereich, der die Größen der beladenen Nanopartikel oder konjugierten Polymere abdeckt. Diese Informationen werden dann auf einen firmeneigenen Algorithmus angewandt, um die Nukleinsäure- oder Wirkstoffbeladung oder das konjugierte Protein in der Probe zu quantifizieren. Da die Analyse bei jedem Elutionsvolumen erfolgt, wird die Beladung als Funktion der Größe bestimmt.

Instrumentierung

Die Nanokonjugat-Analyse kann in Verbindung mit der SEC verwendet werden, wenn die Proben in Bezug auf Größe und Stabilität mit dieser Methode kompatibel sind. Größere Partikel oder solche, die sich durch die Scherkräfte der Säule zersetzen könnten, können durch Feldflussfraktionierung (FFF) mit dem Eclipse^™ FFF-System von Wyatt getrennt werden. Das Eclipse-System wird durch HPLC-Module nach Industriestandard unterstützt und lässt sich nahtlos mit den MALS- und dRI-Detektoren von Wyatt kombinieren.