Die Analyse von makromolekularen Konjugaten in Lösung wird durch Lichtstreuung erheblich vereinfacht.
 

Konjugation

Viele interessante und nützliche Makromoleküle bestehen aus zwei chemisch und physikalisch unterschiedlichen Spezies, die kovalent verbunden sind. Dies kann es recht schwierig machen, die wesentlichen Eigenschaften molarer Masse und Größe durch Größenausschlusschromatographie zu charakterisieren, da keine Kalibrierstandards existieren, die das Elutionsverhalten dieser Verbindungen wiederspiegeln. Oft ist einer oder beide der Hauptbestandteile nicht für die Massenspektrometrie geeignet.

Die Kombination von Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS), UV- und Brechungsindex-Detektion (RI) mit Größenausschlusschromatographie sowie ASTRAs Algorithmus zur Konjugatanalyse bietet die Lösung für die Charakterisierung konjugierter Makromoleküle wie z. B.

  • Block-Copolymere
  • Glykoproteine, Lipoproteine und Nanodiscs
  • PEGylierte Proteine
  • In Detergenzmizellen solubilisierte Membranproteine
  • Protein-Polysaccharid-Impfstoffe
  • Antikörper-Wirkstoff-Konjugate

Konzeptionell kann ein Komplex, der aus einem Protein, das einen UV-Chromophor enthält und einem Modifikator wie Polyethylenglykol oder PEG, das keinen UV-Chromophor enthält, besteht, durch die Kombination von Informationen aus zwei verschiedenen Messungen analysiert werden. Die UV-Absorption bestimmt die Proteinkonzentration, während der RI die Gesamtkonzentration des Makromoleküls bestimmt. Die Modifikatorkonzentration ist die Differenz zwischen diesen beiden Werten. Eine genaue Berechnung berücksichtigt die Extinktionskoeffizienten und unterschiedlichen Brechungsindizes beider Spezies und berechnet den Brechungsindex des Komplexes. Diese beiden Messungen sind ausreichend, um das Verhältnis von Protein und Modifikator im Komplex zu bestimmen. Diese Analyse kann jedoch nicht die Gesamtmasse oder den oligomeren Zustand der Spezies bestimmen.

Die Hinzunahme eines MALS-Detektors bietet die Antwort auf die vollständige Charakterisierung der Konjugate. Da die Lichtstreuung proportional zum Produkt aus molarer Masse und Konzentration ist, reicht die Kombination dieser drei Signale aus, um nicht nur das Verhältnis, sondern die tatsächliche molare Masse und damit den oligomeren Zustand jedes Bestandteils zu bestimmen. Diese Information ist entscheidend für die Beurteilung der Aggregation von Konjugaten, die Messung der molaren Masse von Block-Copolymeren oder die Entscheidung, ob ein durch Detergenz solubilisiertes Membranprotein als natives Oligomer vorliegt oder nicht.

Ausgewählte Referenzen

Abbas, S.; Lodge, T. P. Depletion interactions: effects of added homopolymer on ordered phases formed by spherical block copolymer micelles. Macromolecules  2008, 41, 8895-8902.

Bensaid, F.; du Boullay, O. T.; Amgoune, A.; Pradel, C.; Reddy, L. H.; Didier, E.; Sablé, S.; Louit, G.; Bazile, D.; Bourissou, D. Y-Shaped mPEG-PLA cabazitaxel conjugates: Well-controlled synthesis by organocatalytic approach and self-assembly into interface drug-loaded core-corona nanoparticles. Biomacromolecules  2013, 14, 1189-1198.

Berguig, G. Y.; Convertine, A. J.; Shi, J.; Palanca-Wessels, M. C.; Duvall, C. L.; Pun, S. H., Press, O. W.; Stayton, P. S. Intracellular delivery and trafficking dynamics of a lymphoma-targeting antibody-polymer conjugate. Mol. Pharm.  2012, 9, 3506-3514.

Peng, Y.; Zhang, L. Characterization of a polysaccharide-protein complex from Ganoderma tsugae mycelium by size-exclusion chromatography combined with laser light scattering. J. Biochem. Bioph. Meth.  2003, 56, 243-252.

Slotboom, D. J.; Duurkens, R. H.; Olieman, K.; Erkens, G. B. Static light scattering to characterize membrane proteins in detergent solution. Methods  2008, 46, 73-82.

BIBLIOGRAPHISCHE SUCHE

Instrumente für Konjugatanalyse

MALS Detektoren

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DAWN® - Der empfindlichste MALS-Detektor, der auf dem Markt erhältlich ist. Beinhaltet Detektoren in 18 Winkeln zur Bestimmung der molaren Massen im Bereich von 200 Da bis 1 GDa und Radien von 10 - 500 nm.

  • Standardoption: Umgebungstemperatur
  • Option Heizen/Kühlen: -15 °C bis +150 °C
  • Hochtemperatur-Option: Umgebungstemperatur bis +210 °C

Das DAWN bietet spezielle Optionen zur Messung fluorezierender Proben: Fluoreszenzsperrfilter und einen Infrarot-Laser mit 785 nm.


miniDAWN®
- In der Empfindlichkeit nur vom DAWN übertroffen. Beinhaltet Detektoren in 3 Winkeln zur Bestimmung der molaren Massen im Bereich von 200 Da bis 10 MDa und Radien von 10 - 50 nm bzw. 150 nm, mit speziellen Streufunktionen. Nicht temperiert.

microDAWN® - Der erste MALS-Detektor für UHPLC, mit einer Interdetektor-Dispersion von nur 1,5 µL. Beinhaltet Detektoren in 3 Winkeln zur Bestimmung der molaren Massen im Bereich von 200 Da bis 20 MDa und Radien von 10 - 50 nm. Nicht temperiert.

Brechungsindex-Detektoren

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Optilab® - Ein einzigartiges Online-Differenzialrefraktometer zur Konzentrationsmessung beliebiger Makromoleküle, unabhängig von Chromophoren. Die Hochkonzentrationsoption ermöglicht die Bestimmung von Proteinkonzentrationen bis zu 180 mg/mL.

microOptilab - Der erste RI-Detektor, der speziell für die Verwendung mit allen UHPLC-Systemen entwickelt wurde.

Feldflussfraktionierungssysteme

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Die Feldflussfraktionierung führt vielseitige Trennungen von Makromolekülen und Nanopartikeln im Bereich von 1 bis 1000 nm im Radius und darüber hinaus durch. FFF-MALS-DLS ist das ideale Mittel, um Verteilungen von molarer Masse und Größe, Nanopartikelkonzentration und eine erweiterte Charakterisierung von Konformation und Konjugatgehalt zu erhalten.

Eclipse - FFF-Gerät mit überlegener Leistung, Zuverlässigkeit und Benutzerfreundlichkeit. Unterstützt das Dilution Control Module für erhöhte Empfindlichkeit und die SEC-Umschaltoption für die Nutzung des Systems im FFF- oder SEC-Trennungsmodus.

Mobility EAF4-System - Add-on zu einer Eclipse, das eine FFF mit elektrischen/asymmetrischen Fluss zur Bestimmung von Ladungs- und Zetapotentialverteilungen durchführt.

Eclipse-Kanäle - Die Eclipse bietet eine große Auswahl an Trennkanälen und Membranen, um eine Vielzahl von analytischen und sogar semipräparativen Aufgaben zu erfüllen.

Software

ASTRA® - Unsere umfassende Softwarelösung für die MALS-Analyse im Chromatographie-, FFF- oder Batch-Modus. ASTRA ist in einer 21CFR(11)-konformen Version erhältlich und bietet zusätzliche Optionen wie die Partikelanalyse.