Die Charakterisierung von Nanopartikeln ist vielfältig, gewinnt immer mehr an Bedeutung und deckt eine Vielzahl von Herausforderungen ab:

  • Bestimmung von Größe, Konzentration, Beladung und Konformation von funktionalisierten Nanobiotherapeutika und diagnostischen Nanomarkern
  • Stabilitätsbewertungen von kolloidalen Suspensionen oder Emulsionen für die inhalative Verabreichung von Medikamenten mit kontrollierter Freisetzung
  • Detektion und Identifizierung von kleinen Mengen industrieller Zusatzstoffe, die in die Umwelt gelangen können
  • Analyse der Größenverteilung, des Zeta-Potenzials und des Aggregationsverhaltens in Abhängigkeit von den Lösungsbedingungen, einschließlich pH-Wert und Ionenstärke, von Nanopartikeln, Emulsionen und Kolloiden, die in Lebensmitteln, Kosmetika, der Halbleiterverarbeitung und einer Vielzahl anderer Verbraucher- oder Industrieprodukte verwendet werden.

Das Produktportfolie von Wyatt bietet wesentliche analytische Instrumente für Nanopartikel, kombiniert mit einem unvergleichlichen Grad an Automatisierung, Empfindlichkeit und Auflösung. Durch die Umwandlung herkömmlicher manueller Messungen mit geringem Durchsatz in automatisierte Workflows mit hohem Durchsatz eröffnen sich Wissenschaftlern und Ingenieuren, die in diesem Bereich arbeiten, eine Fülle neuer Möglichkeiten.

Die Messtechniken, die bei der Charakterisierung von Nanopartikeln und Kolloiden in Wyatt-Geräten zum Einsatz kommen, sind die Dynamische Lichtstreuung(DLS), die Statische Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS), die Feldflussfraktionierung(FFF) und die Elektrophoretische Lichtstreuung (ELS).

Eigenschaften

Größenverteilung

Größenverteilung

DLS ist die gängigste Methode, um die Größe von Nanopartikeln und anderen kolloidalen Suspensionen abzuschätzen und um sogar eine grobe Größenverteilung in allen Arten von Lösungsmitteln mit relativ geringem Zeitaufwand, zu erhalten.

Bei den meisten DLS-Geräten müssen Sie jedoch manuell eine Küvette mit einer Probe füllen, die Küvette in das Gerät einsetzen, die Software bedienen um die Datenerfassung zu starten, dann die Küvette waschen und den gesamten Vorgang mit der nächsten Probe wiederholen, was zeitaufwendig und mühsam ist. Wyatt bietet zwei Methoden zur Automatisierung der DLS an, so dass Sie Dutzende oder sogar Hunderte von Proben messen können. So haben Sie mehr Zeit für andere Dinge und können Ihre Produktivität um das Zehnfache steigern.

  • Der DynaPro® Plate Reader führt DLS-Messungen in situ in Standard-Mikrotiterplatten mit bis zu 96, 384 und sogar 1536 Proben durch. Auf diese Weise können Hunderte oder Tausende von Proben pro Tag charakterisiert werden.
  • Das Mobius, das simultane DLS- und elektrophoretische Mobilitätsmessungen zur Bestimmung von Größe und Zetapotenzial kombiniert, kann an Standard-Autosampler und HPLC-Pumpen angeschlossen werden, um Dutzende von Größen- und Zetapotenzialmessungen zu automatisieren. Das Mobius arbeitet mit organischen und wässrigen Lösungsmitteln.
  • Wenn keine Automatisierung benötigt wird, bietet das DynaPro® NanoStar® komfortable küvettenbasierte DLS-Messungen über einen sehr weiten Temperaturbereich und mit einem Probenvolumen von nur 1,25 µL.

Wenn hochauflösende Größenverteilungen von Nanopartikelsuspensionen bestimmt werden sollen, ist die Feldflussfraktionierung (FFF) mittels Eclipse gekoppelt mit einem DAWN® MALS-Detektor mit optional integriertem WyattQELS DLS-Modul das geeignete Analysewerkzeug. Das NanoStar bietet auch eine Online-DLS-Detektion in Verbindung mit einem Wyatt MALS-Detektor und kann einfach auf küvettenbasierte DLS zurückgeschaltet werden, wenn die Online-Funktion aktuell nicht benötigt werden sollte.

FFF ist konzeptionell mit der Größenausschlusschromatographie verwandt, bietet jedoch eine Trennleistung, die weit über die von SEC hinausgeht und den Bereich von 1 - 1000 nm mit exzellenter Auflösung abdeckt. Während unfraktionierte DLS bestenfalls Partikel unterscheidet, die sich in der Größe um das vier- bis fünffache unterscheiden, können FFF-MALS und FFF-DLS Partikel genau charakterisieren, die sich in der Größe nur um wenige Prozent unterscheiden!

MP-PALS Setup

Der DynaPro Plate Reader bietet automatisierte dynamische Lichtstreuungsmessungen mit hohem Durchsatz, während der Mobius gleichzeitig sowohl das Zetapotenzial als auch die Größe mittels DLS bestimmt.

Size Distributions

Die hochauflösende Analyse von Duke-Partikelstandards mittels FFF-MALS zeigt die inhärente Polydispersität jeder Partikelgröße.

Partikelkonzentration

Partikelkonzentration

Die Lichtstreuung ist ein effektives Mittel zur Bestimmung der Partikelkonzentration (Anzahl der Partikel pro mL) und der quantitativen Partikelgrößenverteilung. Eine relativ einfache, schnelle und effektive Möglichkeit dazu ist die Batch-DLS in Kombination mit statischer Einzelwinkel-Lichtstreuung (SLS); diese Technik ist am zuverlässigsten, wenn die Probe hauptsächlich aus einer oder zwei Populationen mit unterschiedlichen Größen besteht und der Partikelradius nicht mehr als etwa 160 - 170 nm beträgt. Sowohl DynaPro NanoStar als auch DynaPro Plate Reader sind in der Lage, Partikelkonzentrationen auf diese Weise zu bestimmen.

Eine wesentlich zuverlässigere Methode zur Bestimmung der Partikelanzahl ist FFF-MALS, die einen größenbasierten Trennschritt mit einer Lichtstreudetektion und -analyse kombiniert. MALS kann die Anzahl von Nanopartikeln in Lösung in jedem Größenbereich bestimmen, sofern der Brechungsindex des Nanopartikels bekannt ist. Es hat sich gezeigt, dass FFF-MALS die Partikelanzahl von Viren, Liposomen und anderen Nanopartikeln mit ähnlichen Ergebnissen wie die TEM-Zählung bis auf wenige Prozent genau bestimmen kann. Die Partikelkonzentration mittels FFF-MALS ist mit der „Partikel-Tracking-Analyis“ vergleichbar, deckt einen größeren Größenbereich ab und erfordert keine sorgfältige Verdünnung auf einen engen Konzentrationsbereich.

Number Density

Analyse der Adenovirusgröße und Partikelkonzentration für jede eluierende Fraktion mittels FFF-MALS.

Eclipse FFF System

Ein FFF-MALS-System besteht aus Eclipse-FFF-Instrument und -Kanal, DAWN-MALS-Detektor, Optilab dRI-Detektor zusammen mit Pumpe, Autosampler und UV-Detektor.

Konformation

Konformation

Obwohl die Lichtstreuung keine hochauflösenden Bilder von Nanopartikeln liefert, ist sie ein effektives Mittel, um etwas über die Verteilung der Gestalt Formen oder anderen Konformationseigenschaften in Partikelproben zu erfahren. Dies wird mit drei Geräten erreicht: einem Eclipse-FFF-Trennsystem, einem DAWN-Detektor und einem WyattQELS-DLS-Modul, das in den DAWN Detektor integriert ist.

FFF trennt die Partikel nach Größe. Wenn die Elutionsvolumen durch das DAWN fließen, werden mittels Lichtstreuung zwei unabhängige Messungen durchgeführt: Bestimmung des rms-Radius Rg, mittels MALS und Bestimmung des hydrodynamischen Radius Rh, mittels DLS. Das Verhältnis Rg:Rh, bekannt als der "Formfaktor", liefert einen Hinweis auf primäre Strukturparameter.

Für die richtige Interpretation des Formfaktors sind einige grundsätzliche Informationen über die erwartete Form erforderlich. Wenn bekannt ist, dass die Partikel elliptisch und von einheitlicher Zusammensetzung sind, gibt der Formfaktor den Grad der Abweichung von der Sphärizität und das Achsenverhältnis an. Wenn bekannt ist, dass die Partikel kugelförmig sind, es sich aber um Hohlkugeln oder gleichförmige Kugeln handeln kann, gibt der Formfaktor die tatsächliche Konformation an. Ebenso kann eine Vielzahl einfacher, wohldefinierter Strukturen identifiziert werden.

conformation

FFF-MALS-DLS Formfaktoranalyse von zwei Partikeln: kugelförmig (Erwartungswert = 0,77) und stäbchenförmig (Erwartungswert > 1,1).

Zusammensetzung

Zusammensetzung

Ein FFF-MALS/DLS-System kann für die Elementaranalyse mit ICP-MS gekoppelt werden. Dadurch werden die Größe und die relative Verteilung der eluierten Partikel mit der elementaren Zusammensetzung korreliert, die durch ICP-MS bestimmt wird. Diese kombinierte Technik wird verwendet, um die Größe und chemische Zusammensetzung von Nanopartikeln zu untersuchen, die in Lebensmitteln gefunden werden, sowie die Art der Metalle, die mit nanopartikulären Fraktionen assoziiert sind, die aus natürlichen Quellen wie Seen und Bächen gewonnen werden.

Die Nutzlast von Nanodrug-Delivery-Partikeln wie Lipid-Nanopartikeln, Liposomen oder PLGA kann durch SEC-MALS oder FFF-MALS in Kombination mit UV- und RI-Detektion bestimmt werden. Ein Beispiel finden Sie im Abschnitt zur kontrollierten Wirkstofffreisetzung auf dieser Seite.

Gold Nanoparticle Composition

Der Goldgehalt von Partikeln unterschiedlicher Größe. Die Größe wurde durch on-line DLS vor dem ICP-MS-System bestimmt.

Formulierung

Formulierung

Hochdurchsatz-Screening von Aggregation und Stabilität von Nanopartikeln in einer Fülle von verschiedenen Lösungsmitteln und Lösungsbedingungen ist für produktive Formulierungsstudien unerlässlich. Der DynaPro Plate Reader ist ein echtes Arbeitstier, wenn es um die Charakterisierung von Formulierungsbedingungen geht, da er DLS-Screening an Hunderten von Proben in situ und unbeaufsichtigt in Standard-Mikrotiterplatten durchführt, um Größe, Polydispersität und Aggregation zu bestimmen. Der DynaPro Plate Reader lässt sich problemlos mit Liquid-Handling-Robotern kombinieren, um die Produktivität noch weiter zu steigern.

Wenn kein hoher Durchsatz benötigt wird, ist das DynaPro NanoStar ein vielseitiges Instrument, das durch Kopplung mit einem Wyatt MALS-Detektor auch online DLS (z. B. für FFF-DLS) messen kann.

Neben der Größen- und Aggregationsanalyse gilt das Zetapotenzial als wichtiger Stabilitätsindikator für Nanopartikel- und kolloidale Suspensionen. Da das Zetapotenzial von Lösemittelbedingungen und Hilfsstoffen beeinflusst wird, profitiert dessen Charakterisierung für Formulierungsoptimierung von einem hohen Automatisierungsgrad. Das Mobius kombiniert die simultane DLS-Größenbestimmung und die elektrophoretische MP-PALS-Mobilitätsbestimmung, um das Zetapotenzial zu bestimmen. Es ist kein Wechsel zwischen DLS- und PALS-Modus erforderlich. Einzigartig ist, dass Mobilitätsmessungen im Mobius manuell oder automatisch mittels eines Standard-HPLC-Autosamplers unter Verwendung der Flusszelle durchgeführt werden können. Das Atlas-Zusatzmodul erhöht den Nutzen des Mobius, indem es Messungen auch unter Bedingungen mit hoher Ionenstärke ermöglicht.

Multiple Wells

Automatisches Screening von Dutzenden oder Hunderten von Nanopartikelformulierungen auf Größe durch DLS mit einem DynaPro Plate Reader

Polymer CMT

Gleichzeitige Statische und Dynamische Lichtstreuungsmessungen in einem DynaPro NanoStar Küvetten-basierten DLS-Instrument zeigen die kritische Mizellentemperatur eines Polymersoms. Der NanoStar lässt sich auch optisch an ein DAWN-MALS-Detektor koppeln, um als Online-DLS-Detektor zu dienen.

Kontrollierte Wirkstofffreisetzung

Kontrollierte Wirkstofffreisetzung

Lichtstreuung und Feldflussfraktionierung bieten Charakterisierungsmöglichkeiten, die bei der Entwicklung neuartiger Nanopartikel-Wirkstofffreisetzungssysteme (nanoDDS) unerlässlich sind, unabhängig davon, ob das Trägervehikel ein Liposom, eine Polymermizelle oder ein anderes hergestelltes Nanopartikel ist.

Die grundlegende Größenbestimmung von nanoDDS wird in der Regel zunächst in einem Batch (unfraktioniert) Dynamischen Lichtstreuinstrument (DLS) durchgeführt, das Messungen in einer Mikroküvette vornimmt, wie z. B. einem DynaPro NanoStar. Weitaus genauere Größenverteilungen werden jedoch in Kombination mit Fraktionierung erhalten, z. B. SEC-MALS für Partikel bis zu ~ 100 nm Größe oder FFF-MALS für Partikel bis zu 1000 nm Größe. Beide Techniken sind empfindlich genug um Partikel aufzulösen, die sich in einer heterogenen Verteilung nur um wenige nm im Radius unterscheiden.

Eine der wichtigsten analytischen Herausforderungen bei der Entwicklung von nanoDDS ist die Bestimmung, ob ein Medikament, ein therapeutisches Peptid oder eine RNA in den Träger eingebaut, an die Außenseite gebunden oder frei in Lösung ist. Die Kombination von SEC oder FFF mit einem DAWN-MALS-Detektor und dem WyattQELS online DLS-Modul kann bei der Beantwortung dieser Fragen helfen, indem die Konformation der Partikel identifiziert und ungebundene Moleküle sowohl nachgewiesen als auch quantifiziert werden.

Um stabile Formulierungen zu entwickeln, können nanoDDS-Konstrukte in Dutzenden oder sogar Hunderten von Formulierungen im DynaPro Plate Reader charakterisiert werden, um Bedingungen zu ermitteln, die minimale Aggregation gewährleisten. Das Mobius ist ideal für die automatisierte Messung des Zetapotenzials von Drug-Delivery-Nanopartikeln in verschiedenen Formulierungspuffern, sowie von Puffern mit hohem Salzgehalt. Solche Puffer stören herkömmliche Zetapotenzialmessungen, weil sich durch Elektrolyse Blasen an den Elektroden und damit auch im optischen Weg bilden.

biologics nanoparticle characterization

Nanokonjugat-Analyse des RNA-Gehalts in Abhängigkeit von der Größe in einer LNP-Formulierung von mRNA, erhalten mit FFF-MALS-UV-dRI.

Techniken & Literatur

Prozessbegleitende Analytik (PAT)

Bei der Herstellung von Lipid-Nanopartikeln, Viren, Polymermizellen und anderen Nanopartikeln überwachen die meisten PAT-Instrumente Prozessbedingungen wie pH-Wert, Temperatur, Druck und Rohstoffverbrauch. Erst am Ende des Prozesses messen QC-Verfahren die tatsächlichen physikalischen Eigenschaften, die die Produktqualität definieren. Dank RT-MALS gehört dies der Vergangenheit an.

Echtzeit-Mehrwinkel-Lichtstreuung (RT-MALS) ist eine neuartige PAT-Anwendung der Lichtstreuung, die direkt die Größe (z-mittlerer rms-Radius) von Nanopartikeln mit Durchmessern von 25 bis 500 nm bestimmt. Durch den Einsatz des ultraDAWN-RT-MALS-Detektors, inline oder online während der Produktion, der Reinigung und anderen Prozessschritten, kann das Fertigungspersonal die Prozessentwicklung beschleunigen, optimieren und dabei durch das sofortige Feedback über die Auswirkungen von Prozessvariationen und -abweichungen entscheiden.

Nach der Entwicklung des Prozesses kann das ultraDAWN einfach weiterhin online verwendet werden. Die zugehörige Software, OBSERVER, lässt sich in eine OPC-AU-Umgebung für den automatisierten und/oder GMP-Betrieb integrieren. OBSERVER kann so programmiert werden, dass das System auf Abweichungen vom zulässigen Größenbereich aufgrund von Prozessdrift reagiert oder eine Reaktion abbricht, sobald der Endpunkt erreicht ist.

OBSERVER

Ausgewählte Literatur

Ausgewählte Literatur

Afonin, K. A.; Kasprzak, W.; Bindewald, E.; Puppala, P. S.; Diehl, A. R.; Hall, K. T.; Kim, T. J.; Zimmermann, M. T.; Jernigan, R. L.; Jaeger, L.; Shapiro, B. A. Computational and experimental characterization of RNA cubic nanoscaffolds. Methods  2014, 67, 256-265.

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Loeschner, K.; Navratilova, J.; Legros, S.; Wagner, S.; Grombe, R.; Snell, J.; von der Kammer, F.; Larsen, E. H. Optimization and evaluation of asymmetric flow field-flow fractionation of silver nanoparticles. J. Chromatogr. A  2013, 1272, 116-125.

Perevyazko, I. Y.; Delaney, J. T.; Vollrath, A.; Pavlov, G. M.; Schubert, S.; Schubert, U. S. Examination and optimization of the self-assembly of biocompatible, polymeric nanoparticles by high-throughput nanoprecipitation. Soft Matter  2011, 7, 5030-5035.

Wyatt, P. Submicrometer particle sizing by multiangle light scattering following fractionation. J. Colloid Interf. Sci.  1998, 197, 9-20.

PL2609: FFF-MALS-DLS nanoDDS key publications

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