Grundlagen CG-MALS

Im Idealfall der hohen Verdünnung kann die thermodynamische Nichtidealität, z. B. Virialkoeffiziententerme, ignoriert werden und die zeitlich gemittelte Lichtstreuintensität einer Lösung, die ein oder mehrere Makromoleküle enthält, wird durch diese Gleichung beschrieben:

wobei:

• M_m, c_m, P_m(θ) und dn/dc_m sich auf die molare Masse, die Masse/Volumenkonzentration, die Winkelabhängigkeit aufgrund des endlichen R_g und den spezifischen Brechungsindex der molekularen Spezies m beziehen
• [m] ist die molare Konzentration der Spezies m
• R_(θ) und K entsprechen den Definitionen in der klassischen Lichtstreuung, mit der Ausnahme, dass das dn/dc in K* enthalten ist, um einen probenunabhängigen Parameter K zu erhalten

Der Idealfall gilt typischerweise unterhalb von ~1 mg/mL Gesamtkonzentration für die meisten Proteine in einem Puffer mit angemessener Ionenstärke. Für andere Makromoleküle und Lösungsmittel kann der Gültigkeitsbereich variieren.

Innerhalb dieser Grenzen wird davon ausgegangen, dass ein reversibel assoziierendes System im dynamischen Gleichgewicht aus einem Gemisch aus 1) freien Monomeren A, B mit den Molmassen M_A und M_B bei den Konzentrationen [A] und [B]; and 2) gebundenen Komplexen A_i B_j mit der Molmasse M_ij = iM_A + jM_B bei den Konzentrationen [A_i B_j] besteht. In Anlehnung an den Formalismus von Attri & Minton 2005¹, besteht die Datenanalyse aus der Kombination der idealen Lichtstreugleichung, die im Folgenden als (1) umgeschrieben wird, mit den Gleichungen für die Massenwirkung (2) und die Erhaltung der Masse (3):

(1)

(2)

(3)

• Hier stehen A₁ B₀ und A₀ B₁ für die Monomere A und B; A_i B₀ steht für das i-mere von A und A₀B_j für j-mere von B.
• In Gl. (2) sind K_ij die makroskopischen Gleichgewichtskonstanten für den Komplex ij
• In Gl. (3) sind c_A^total und c_B^total die gesamte Masse-/Volumenkonzentration von A und B, die gesamte Masse-/Volumenkonzentration von c_A^total und c_B^total werden direkt während eines CG-MALS-Experiments gemessen.

Literatur
¹ Attri, A. K.; Minton, A. P. Composition gradient static light scattering: A new technique for rapid detection and quantitative characterization of reversible macromolecular hetero-associations in solution. Analytical Biochemistry  2005, 346, 132–138.

Unspezifische Wechselwirkungen zwischen Makromolekülen entstehen aus einer Vielzahl von Quellen: Abstoßung im harten Kern, Abstoßung oder Anziehung aufgrund elektrostatischer Nettoladungen auf Moleküloberflächen, Anziehung aufgrund verschiedener Dipole und Terme höherer Ordnung (Monopol-Dipol, Dipol-Dipol, usw.), hydrophobe Bereiche bei Proteinen oder Peptiden, Hydratationskräfte, usw. Solche Wechselwirkungen werden durch das Lösungsmittel vermittelt und daher durch Ionenstärke und pH-Wert beeinflusst. Sie führen nicht zu einer spezifischen Schlüssel-Schloss-Bindung, um Komplexe mit wohldefinierter Stöchiometrie zu erzeugen, sondern erzeugen eine allgemeine Anziehung oder Abstoßung zwischen Makromolekülen. Unter relativ verdünnten Bedingungen, die sich dem Idealfall annähert aber diese nicht erreichen, werden unspezifische Selbstwechselwirkungen durch Virialkoeffizienten quantifiziert, insbesondere durch den zweiten Virialkoeffizienten A₂ auch bekannt als B₂₂ und den dritten Virialkoeffizienten A₃ (B₂₂₂). Die statische Lichtstreugleichung im verdünnten, nicht-idealen Bereich wird üblicherweise mit Gleichung 4 beschrieben:

(4)

Oder

(5)

Sowohl P_(θ) = 1 als auch Q_θ = 1 gilt für Moleküle, die viel kleiner sind als die Wellenlänge des einfallenden Lichts, typischerweise mit Radien < 8 – 10 nm. Unspezifische Hetero-Wechselwirkungen werden zweckmäßigerweise durch Kreuzviralkoeffizienten, insbesondere A₁₁ (B₂₃), beschrieben. Es gibt verschiedene Formalismen zur Beschreibung der Lichtstreuung mit Eigen- und Kreuzviralkoeffizienten. Eine häufig verwendete Variante ist:

(6)

In diesen Gleichungen wird nicht nach stöchiometrischen Komplexen unterschieden; >c, c_A und c_B beziehen sich auf die Gesamtkonzentrationen der Probe.

Bei hohen Konzentrationen, typischerweise über 10 mg/mL und bis zu Hunderten von mg/mL für Proteine und ähnliche Makromoleküle, können schwache Wechselwirkungen, die verdünnte oder mäßig konzentrierte Lösungen nicht beeinflussen, wichtig werden. Die Analyse von CG-MALS-Daten, die bei solch hohen Konzentrationen erfasst wurden, wird durch das gleichzeitige Vorhandensein von abstoßenden Wechselwirkungen insbesondere die immer vorhandene Hard-Core-Abstoßung und einer Vielzahl von unspezifischen, anziehenden Wechselwirkungen erschwert. Glücklicherweise neigen abstoßende und anziehende Wechselwirkungen dazu, unterschiedliche Funktionsformen in ihrer Konzentrationsabhängigkeit zu erzeugen, wodurch sie gleichzeitig unterschieden und quantifiziert werden können.

Signale aus einer primär repulsiven Wechselwirkung werden oft gut durch das Effective Hard Sphere (EHS)-Modell¹. EHS verwendet einen einzigen Parameter, das effektive spezifische Volumen v_eff, aus dem alle Virialkoeffizienten berechnet werden können, was das Anpassungsverfahren robust macht. Somit gilt für die Extrapolation auf den Winkel Null oder bei jedem Winkel für isotrope Streuer, also Moleküle mit einem Radius unter 8 - 10nm:

(7)

Minton beschriebt ein Modell für die Analyse hochkonzentrierter Selbstwechselwirkungen, indem er annimmt, dass die gesamte Anziehung als reversible Oligomerisierung beschrieben werden kann, während die gesamte Abstoßung in einem einzigen Parameter zusammengefasst werden kann: dem effektiven spezifischen Volumen v_eff das für Monomere und alle Oligomeren als gleich angenommen wird. Diese Oligomere sind möglicherweise keine echten spezifischen Komplexe mit robusten Stöchiometrien, sondern können als quasi-spezifische Oligomere mit ungefähren Stöchiometrien betrachtet werden, die sich bei veränderten Lösungsmittelbedingungen verschieben können. Der vollständige Algorithmus zur Anpassung von Hochkonzentrationsdaten an ein Selbstassoziationsmodell und zur Bestimmung der Stöchiometrie, der i-mer Gleichgewichtsassoziationskonstanten K_i und v_eff ist komplex. Einen vereinfachten Satz von Gleichungen, der das Wesentliche eines selbstassoziierenden Systems in Anwesenheit von (repulsiver) Nicht-Idealität angemessen wiedergibt, erhält man durch Kombination von Gleichung (7) mit den Gleichungen (1) - (3):

(8)

(9)

(10)

Literatur:
¹ Minton, A. P. Light Scattering from Concentrated Protein Solutions, I: General Theory for Protein Mixtures and Application to Self-Associating Proteins. Biophysical Journal  2007, 93, 1321-1328.

Für die Lichtstreuung gilt die Standard-Reaktionskinetik der Lösung. Das Streusignal ist proportional zu dem Produkt aus Konzentration und molarer Masse, so dass die Daten durch einen entsprechenden Gleichungssatz beschrieben werden. Für den einfachen Fall von A+B↔AB, ergibt sich eine Kinetik 2ter Ordnung:

(11)

(12)

Die Zeitabhängigkeit der Streulichtintensität, extrapoliert auf den Winkel Null oder bei jedem Winkel für isotrope Streuer, also Teilchen mit Radius < 8 – 10 nm, ist:

(13)