Die Größe von Makromolekülen oder Nanopartikeln wird über zwei Lichtstreuungsmethoden gemessen: Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS) und Dynamische Lichtstreuung (DLS). Jede Technik trägt entscheidende Teile der Charakterisierung bei.
 

Größe

Sowohl die Statische Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS) als auch die Dynamische Lichtstreuung (DLS) ermöglichen zerstörungsfreie Größenmessungen in Lösung auf der Basis absoluter Analysen, unabhängig von Kalibrierstandards. Diese Techniken sind komplementär und orthogonal indem sie unterschiedliche Eigenschaften des gestreuten Lichts analysieren:

I. Größe mit MALS

MALS untersucht die Winkelabhängigkeit der zeitlich gemittelten Lichtstreuintensität, um den Streumassenradius Rg (auch bekannt als „Gyrationsradius“) von 10 nm bis zu mehreren hundert Nanometern, unabhängig von der Form zu bestimmen, wie in der klassischen Lichtstreutheorie beschrieben.

Entspricht die Probe bestimmten Formmodellen wie Kugel, Stäbchen, Random Coil oder beschichtete Kugel, dann kann der Radius oder die halbe Stäbchenlänge mit einem DAWN® 18-Winkel-MALS-Detektor bis zu einer Größe von 1000 nm bestimmt werden. miniDAWN® und microDAWN® 3-Winkel-Detektoren charakterisieren Größen bis zu 50 nm, unabhängig von der Form, und bis zu 150 nm, wenn die Probe formspezifischen Modellen entspricht.

II. Größe mittels DLS

DLS nutzt die zeitabhängigen Fluktuationen der Lichtstreuintensität, die durch Brownsche Molekularbewegung entstehen, um die Diffusionskonstante zu bestimmen. Der hydrodynamische Radius Rh wird dann direkt, wie in der DLS-Theorie beschrieben, berechnet. Im Gegensatz zu MALS erfordert DLS in der Regel keine genaue Kenntnis der Probenkonzentration, benötigt aber genaue Werte für die Viskosität des Lösungsmittels und die Temperatur.

DLS bestimmt die Größe über die Fluktuationsrate des Lichtstreusignals.

III. Größe durch Viskosimetrie

Für Polymere ist die Größenbestimmung durch Viskosimetrie oft besser geeignet als DLS. Die Größe wird aus der Einstein-Simha-Gleichung bestimmt, die die intrinsische Viskosität mit der Größe und der molaren Masse in Beziehung setzt. Die Viskosimetrie ist für kleine Makromoleküle empfindlicher als DLS und ist daher die bevorzugte Technik für Polymere und Peptide unter 10 nm im Radius.

Größenverteilungen durch Online-Fraktionierung mittels MALS

Die Kopplung eines MALS-Detektors mit einer Fraktionierungsmethode wie der Größenausschlusschromatographie (SEC-MALS) oder der Feldflussfraktionierung (FFF-MALS) ist die gängigste Methode zur MALS-Charakterisierung von Größenverteilungen homogener oder heterogener Proben. Die MALS-Analyse liefert den rms-Radius Rg des Analyten bei jedem Elutionsvolumen, unabhängig von der Retentionszeit. Da das Detektionsvolumen der MALS-Durchflusszelle viel kleiner ist als ein typischer monomerer Peak, der von der SEC oder der FFF eluiert wird, liefert MALS genaue Größenverteilungen, die in ihrer Auflösung nur durch das Trennverfahren begrenzt sind.


Anwendungen

SEC-MALS und FFF-MALS zur Bestimmung der Größenverteilungen:

  • Biopolymere wie Polysaccharide
  • PEGylierte Proteine und große Proteinkomplexe wie virusähnlichen Partikeln (VLP)
  • Synthetische Polymere
  • Liposome oder Exosome
  • Große Proteinaggregate

Mittlere Größe durch Batch-MALS (unfraktioniert)

Eine unfraktionierte oder „Batch“-Messung liefert den z-gemittelten Radius Rg,z des gesamten Analyten in Lösung. Batch-MALS für Größenmessungen wird durchgeführt, indem die Probe direkt in die DAWN® oder miniDAWN®-Flusszelle injiziert wird. In der Vergangenheit waren Batch-Messungen mühsam und anfällig für Bedienerfehler. Das Calypso® automatisiert Batch-MALS für genaue, zuverlässige und schnelle Ergebnisse.


Anwendungen

Batch-MALS wird häufig zur Analyse eingesetzt für:

  • Sehr große, unstrukturierte Polymere, die sich nicht voneinander trennen lassen
  • Große Proteinkomplexe und -aggregate, die aufgrund der Verdünnung und Scherung während des Trennverfahrens dissoziieren
  • Polymere, die Gele oder viskose Lösungen bilden, die die Kapillaren verstopfen können

Größenverteilungen durch Online-Fraktionierung mittels DLS

DLS kann online während einer SEC- oder FFF-Messung durcjgeführt werden, indem ein WyattQELS-Modul in einen DAWN-, miniDAWN- oder microDAWN-MALS-Detektor integriert wird oder indem das im MALS-Detektor abgegriffene Licht über eine optische Faser zu einem Batch-DLS-Detektor wie dem DynaPro® NanoStar® oder Mobius® übertragen wird. Abhängig vom Winkel, der Laserwellenlänge und der Flussrate kann die Online-DLS Rh von 1 nm bis ~250 nm analysieren.


Anwendungen

  • Quantendots und metallische Nanopartikel, die aufgrund ihrer Größe oder ihres anomalen Brechungsindex nicht mit MALS analysiert werden können
  • Konformation von Proteinen und Proteinaggregaten
  • In Verbindung mit der MALS-Größenbestimmung (Rg), zur Bestimmung der Konformation von Biopolymeren und anderen heterogenen Makromolekülen, z.B. zur Unterscheidung zwischen gefüllten und ungefüllten Liposomen als Wirkstoffträger

Größe durch Batch-DLS (unfraktioniert)

Im Batch-Modus (kein Fluss) kann DLS Partikel mit einem Radius von 0.2 nm bis zu 5000 nm messen. Eine weitere wertvolle Möglichkeit bei DLS im Batch-Modus ist mittels Regularisierungsanalyse eine grobe Größenverteilung zu extrahieren, ohne dass eine Fraktionierung stattfindet. Während die aus der Batch-DLS berechneten Verteilungen nur Populationen klar trennen können, die sich im Radius um etwa das 3- bis 5-fache unterscheiden, können Aggregate und andere Formen der Heterogenität über die Peakbreite, auch Polydispersität genannt, beurteilt werden.

  • Die Kumulantenanalyse bestimmt die Polydispersität einer „monomodalen“ Verteilung von Partikelgrößen
  • Durch die NNLS-Regularisierungsanalyse unterscheidet DLS zwischen Populationen von Partikeln, die sich in der Größe um mindestens das ~3-5-fache unterscheiden

Trotz der geringen Größenauflösung ist DLS empfindlich gegenüber Verschiebungen in der Durchschnittsgröße. Die Fähigkeit, Größenverschiebungen von nur 1-2 % zu erkennen, wird bei der Analyse der Proteinentfaltung am thermischen Schmelzübergang genutzt. Auch bei Protein-Protein-Wechselwirkungen, die über die Konzentrations- oder Zusammensetzungsabhängigkeit der Größe beurteilt werden, und sogar bei der Bindung von Lipiden oder Oligonukleotiden an Nanopartikel ist die Fähigkeit kleine Größenverschiebungen zu erkennen wichtig.

Das DynaPro NanoStar bietet Batch-DLS in hochwertigen Quarz-Mikroküvetten oder Einweg-Kunststoffküvetten, während das DAWN und miniDAWN Batch-DLS in der Durchflusszelle („microbatch“) oder in einer 10-µL-Quarz-Mikroküvette unter Verwendung des microCuvette Adapter Kit bieten.


Applications

  • Schnelle Abschätzung der durchschnittlichen Größe und Polydispersität von organischen und anorganischen Nanopartikeln
  • Schnelle Qualitätskontrolle von Proteinexpression und -reinigung, Prüfung auf große Aggregate
  • Einfache, semi-quantitative Bewertung von Oligomerisierungs- oder Aggregationszuständen
  • Proteinschmelz- und Protein-Protein-Interaktionsstudien

Hochdurchsatz-Größenbestimmung durch Batch-DLS

Zwar ist DLS weniger empfindlich als MALS gegenüber niedrigen Probenkonzentrationen, jedoch ist es auch weniger anfällig für Störungen durch unspezifisches Streulicht und kann daher unter weniger strengen optischen Bedingungen durchgeführt werden. Der DynaPro® Plate Reader macht sich diese besondere Fähigkeit zunutze, um automatisierte DLS-Messungen in situ in Industriestandard-Mikrotiterplatten durchzuführen und dabei Hunderte oder sogar Tausende von Proben und Probenbedingungen pro Tag zu messen.


Anwendungen

  • Hochdurchsatz-Screening optimaler Formulierungsbedingungen für Proteine und biotherapeutische Komplexe wie virusähnliche Partikel, basierend auf Kriterien wie Aggregation und der thermisch induzierten Onset-Temperatur der Aggregation
  • Bestimmung der Schmelztemperatur von Proteinen in Abhängigkeit von den Formulierungsbedingungen (Zusätze, pH-Wert, etc.)
  • Charakterisierung unspezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen über den Diffusionsinteraktionsparameter kD ermittelt aus der Konzentrationsabhängigkeit des Diffusionskoeffizienten

Größenverteilungen durch intrinsische Viskosität + MALS

Wenn Polymere zu klein sind, um Größenverteilungen direkt mit Online-MALS zu bestimmen, bietet die Ergänzung des SEC-Setups durch einen ViscoStar® oder microViscoStar® eine alternative Lösung. Das hydrodynamische Volumen steht über die Einstein-Simha-Beziehung Vh=M[η]/(2.5NA) in direktem Zusammenhang mit dem Produkt aus molarer Masse und intrinsischer Viskosität. Der hydrodynamische Radius kann so über das hydrodynamische Volumen bestimmt werden.

Da sowohl die intrinsische Viskosität als auch die molare Masse ohne Annahmen bestimmt werden, liefert die SEC-MALS-IV-Analyse eine objektive Schätzung der Molekülgröße, die unabhängig von Säuleninteraktionen berechnet wird.

Prozess-MALS

Zusätzlich zu den analytischen Standardanwendungen von MALS kann In-Process-MALS zur Entwicklung, Überwachung und Steuerung von Herstellungsprozessen eingesetzt werden, direkt in der Pilotanlage oder in der Fertigung. Das ultraDAWN zusammen mit der OBSERVER-Software bestimmt und dokumentiert den Streumassenradius (Rg) von Protein- oder Polymerlösungen, die in Echtzeit durch das Gerät laufen. Dieses Verfahren wird als RT-MALS bezeichnet.

Literatur

Ahmad, A.; Uversky, V. N.; Hong, D.; Fink, A. L. Early events in the fibrillation of monomeric insulin. J. Biol. Chem.  2005, 280, 42669-42675.

Aichmayer, B.; Widermann-Bidlack, F. B.; Gilow, C.; Simmer, J. P.; Yamakoshi, Y.; Emmerling, F.; Margolis, H. C.; Fratzl, P. Amelogenin nanoparticles in suspension: deviations from spherical shape and pH-dependent aggregation. Biomacromolecules  2010, 11, 369-376.

Striegel, A. M. Architecture on the mechanochemical degradation of macromolecules. J. Biochem. Bioph. Meth.  2003, 56, 117-139.

Tarazona, M. P; Saiz, E. Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules. J. Biochem. Bioph. Meth.  2003, 56, 95-116.

Wyatt, P. Submicrometer particle sizing by multiangle light scattering following fractionation. J. Colloid Interf. Sci.  1998, 197, 9-20.

BIBLIOGRAPHISCHE SUCHE

Instrumente für die Messung der Größe

Online oder Batch-MALS

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              characterization

DAWN® - Der empfindlichste MALS-Detektor, der auf dem Markt erhältlich ist. Beinhaltet Detektoren in 18 Winkeln zur Bestimmung von molaren Massen von 200 Da bis 1 GDa und Radien von 10 - 500 nm.

  • Standardoption: nicht temperiert
  • Beheizte/gekühlte Option: -15 °C bis +150 °C
  • Hochtemperatur-Option: Umgebungstemperatur bis +210 °C

Das DAWN bietet spezielle Optionen zur Messung fluoreszierender Proben: Fluoreszenzfilter und einen Infrarot-Laser mit 785 nm.

miniDAWN® - Die zweithöchste Empfindlichkeit nach dem DAWN. Beinhaltet Detektoren in 3 Winkeln zur Bestimmung der molaren Masse im Bereich von 200 Da bis 10 MDa und Radien von 10 - 50 nm. Nicht temperiert.

microDAWN® - Der erste MALS-Detektor für die UHPLC, mit einer Interdetektor-Dispersion von nur 1,5 µL. Beinhaltet Detektoren in 3 Winkeln zur Bestimmung der molaren Massen von 200 Da bis 20 MDa und Radien von 10 - 50 nm. Nicht temperiert.

Calypso® - Präparations- und Probenzuführungssystem mit Software zur Durchführung und Analyse von automatisierten Konzentrations- oder Zusammensetzungsgradienten in einem MALS-Detektor. Automatisierung für zuverlässige und reprodizierbare Zimm-Plots sowie Messung von zeit- oder zusammensetzungsabhängiger Größeänderung in einem DAWN oder miniDAWN.

Dynamische Lichtstreudetektoren

DynaPro NanoStar, particle size analysis, size exclusion chromatography, nanoparticle size, nanoparticle analysis

DynaPro® NanoStar® - Der küvettenbasierte DLS-Detektor NanoStar kann eine Doppelfunktion als Online-DLS-Detektor erfüllen indem seine optische Faser an einen Wyatt MALS-Detektor gekoppelt wird.

WyattQELS - Ein DLS-Modul, das in einen DAWN-, miniDAWN- oder microDAWN-MALS-Detektor integriert wird, um simultane DLS-Messungen im gleichen Lichtstreuvolumen wie die primäre MALS-Messung zu ermöglichen.

Viskosimeter

ViscoStar

ViscoStar® - Ein hochempfindliches Online-Differenzviskosimeter, das in Verbindung mit SEC-MALS zur Bestimmung der Größe und Konformation aller Arten von Biopolymeren, synthetischen Polymeren und sogar Proteinen und Peptiden eingesetzt wird.

Das ViscoStar beinhaltet mehrere neuartige Technologien, um die höchste Empfindlichkeit, Stabilität und Lösungsmittelkompatibilität aller verfügbaren Viskosimeter für die GPC zu bieten. Seine Benutzerfreundlichkeit und Wartungsfreundlichkeit machen ihn zur perfekten Ergänzung für die Lichtstreu- und Brechungsindexdetektoren DAWN® und Optilab® von Wyatt. Es verfügt über eine Temperaturkontrolle zwischen 4 °C und 70 °C.

microViscoStar - Ähnlich wie das ViscoStar, jedoch speziell für den Einsatz mit UHPLC/APC entwickelt.

Brechungsindex-Detektoren

Optilab® - Ein einzigartiges Online-Differenzialrefraktometer zur Messung der Konzentration beliebiger Makromoleküle, unabhängig von Chromophoren. Temperaturgesteuert von 4 °C bis 65 °C. Die Hochkonzentrationsoption ermöglicht die Messung von Proteinkonzentrationen bis zu 180 mg/mL.

microOptilab - Der erste RI-Detektor, der speziell für die Verwendung mit UHPLC-Systemen entwickelt wurde.

Batch-DLS-Geräte

DynaPro Plate Reader, particle size analysis, nanoparticle size, nanoparticle analysis

DynaPro® Plate Reader - Das einzige kommerziell erhältliche Instrument, das DLS und SLS direkt in situ in Standard-96er, 384er oder 1536er Mikrotiterplatten misst. Der DynaPro Plate Reader kann in großen Pipettierrobotersystemen integriert werden und führt plattenbasierte Assay-Protokolle aus. Er verfügt über eine Temperatursteuerung von 4 °C bis 85 °C. Eine integrierte Kamera kann von jedem Well zur Fehlersuche und Diagnose ein Bild aufnehmen.

DynaPro® NanoStar® - Mit einem Probenvolumen von nur 1,25 µL und einer Temperaturregelung von -15 °C bis +150 °C geht das NanoStar weit über herkömmliche küvettenbasierte DLS-Geräte hinaus. Es bietet einen optimierten Statischen Lichtstreudetektor parallel zum DLS-Detektionssystem, um die absolute molare Masse zu bestimmen. Das NanoStar erfüllt eine Doppelfunktion als Online-DLS-Detektor, indem seine optische Faser an einen Wyatt MALS-Detektor gekoppelt werden kann.

Mobius® - Kombiniert Größenbestimmung durch Dynamische Lichtstreuung mit gleichzeitigen elektrophoretischen Mobilitätsmessungen. Auch hier kann die optische Faser mit einem Wyatt MALS-Detektor gekoppelt werden um Online-DLS-Messungen durchzuführen.

Calypso® - Präparations- und Probenzuführungssystem sowie Software zur Durchführung und Analyse von automatisierten Konzentrations- oder Zusammensetzungsgradienten in einem MALS-Detektor. Automatisiert zuverlässige und reproduzierbare zeit- oder zusammensetzungsabhängige Größenmessungen mittels DLS in einem DAWN oder miniDAWN, ausgestattet mit einer WyattQELS oder einem NanoStar-Kopplungskit.

microCuvette - Ermöglicht die gleichzeitige Durchführung von Statischen und Dynamischen Lichtstreumessungen in einem DAWN mit einer Quarzküvette mit 10 µL Probenvolumen.

Microbatch Kit - Wird verwendet um Proben in die Durchflusszelle eines MALS-Detektors zu injizieren.

NanoFilter Kit - Erleichtert das Filtern, Rückgewinnen und erneute Filtern wertvoller Proben. Dies ist besonders nützlich, wenn Ihr Gesamtprobenvolumen unter 300 µL liegt.

Feldflussfraktionierungssysteme

eclipse, molar mass determination, molar mass measurement, molar mass analysis, molecular weight measurement, molar mass characterization

Die Feldflussfraktionierung führt vielseitige Trennung von Makromolekülen und Nanopartikeln im Bereich von 1 bis 1000 nm Durchmesser und darüber hinaus durch. FFF-MALS-DLS ist das ideale Mittel, um Verteilungen von molarer Masse und Größe, die Konzentration von Nanopartikeln und eine erweiterte Charakterisierung von Konformation und Konjugatgehalt zu erhalten.

Eclipse - FFF-Instrument mit überragender Leistung, Zuverlässigkeit und Benutzerfreundlichkeit. Optional ist die Eclipse mit dem Dilution Control Module für verbesserte Empfindlichkeit und der SEC-Umschaltoption für den schnellen Wechsel des Systems zwischen FFF- und SEC-Trennmodi erhältlich.

Mobility EAF4-System - Add-on zu einer Eclipse, das die Trennkraft um ein elektrisches Feld während der Feldflussfraktionierungsmessung zur Bestimmung von Ladungs- und Zetapotentialverteilungen erweitert.

Eclipse Channels - Die Eclipse bietet eine große Auswahl an Trennkanälen und Membranen, um eine Vielzahl von analytischen und sogar semipräparativen Aufgaben zu erfüllen.

Software

ASTRA® - Unsere umfassende Softwarelösung für die MALS- und DLS-Analyse im Chromatographie-, AF4- oder Batch-Modus. ASTRA ist in einer 21CFR(11)-konformen Version erhältlich und bietet zusätzliche Optionen wie die Partikelanalyse.

DYNAMICS® - Software für Batch-DLS-Messungen in den DynaPro- und Mobius® Geräten, sowie Messungen der molaren Masse und A2 im NanoStar und DynaPro Plate Reader III und elektrophoretische Mobilität im Mobius. Berechnet Größe und Größenverteilungen und leitet Parameter wie die Schmelztemperatur Tm, die Aggregationstemperatur Tagg und den Diffusionsinteraktionsparameterer kD.

CALYPSO - The CALYPSO-Software analysiert keine DLS-Daten, kann aber genutzt werden, um Verdünnungen oder Zusammensetzungsgradienten zu steuern, die an einen MALS- oder Mobius-Detektor geliefert werden, und die DLS-Datenerfassung durch die Wyatt-Softwarepakete ASTRA oder DYNAMICS auszulösen.

VISION - Steuert das Eclipse Feldflussfraktionierungs-(FFF)-System und verfügt über einen Simulationsmodus zur Methodenentwicklung. Gekoppelt mit ASTRA zur Datenerfassung und -analyse bietet VISION dem Anwender eine Komplettlösung für die makromolekulare Charakterisierung.