大分子或纳米粒子的尺寸通过两种光散射方法进行测量:多角度静态光散射(MALS)和动态光散射(DLS)。 每种技术都是表征难题的关键部分。
 

尺寸

多角度静态光散射(MALS)和动态光散射(DLS)提供基于绝对分析的尺寸测量结果。这些技术是互补和正交的,同时也诠释了散射光的不同性质:

I. 使用MALS测量分子尺寸

MALS通过计算时间平均散射强度的角度依赖性,以确定质量平均均方根半径 Rg (也称为“回转半径”),从10纳米到几百纳米,与形状无关,如经典光散射理论所述。

如果样品符合特定的形状模型,如球体、杆、随机线圈或空心球体,那么其半径或杆半长可由DAWN® 18角MALS检测器测量,且最高上限可达1000 nm。miniDAWN® microDAWN™3角度检测器在表征不规则分子尺寸时,最高上限可达50 nm,如果样品符合特定的形状模型,则最高上限可达150 nm。

II. 使用DLS测量分子尺寸

DLS利用布朗运动引起的散射强度随时间的涨落来确定扩散系数。然后根据 DLS理论直接计算水合半径Rh。与MALS不同,DLS通常不需要准确的样品浓度信息,但需要准确的溶剂粘度和温度。

DLS通过散射信号的曲线来确定尺寸。

III. 使用粘度检测器测量分子尺寸

对于聚合物,用粘度检测器测定尺寸通常比DLS更合适。尺寸的计算由Einstein-Simha方程确定,该方程将特性粘度与尺寸和摩尔质量联系起来。粘度检测器相比于比DLS来说,对较小的聚合物更敏感,因此rg小于10nm以下聚合物和多肽是该仪器的检测领域。

使用在线MALS测量分子尺寸分布

将MALS检测器与尺寸排阻色谱(SEC-MALS)或场流分离(FFF-MALS)等分离方法耦合是表征均匀或非均匀样品尺寸分布的最常用方法。MALS的分析提供了样品在每个洗脱体积的rms半径Rg

应用

SEC-MALS和FFF-MALS可以测量:

  • 生物聚合物,如多糖
  • 聚乙二醇化蛋白质和高蛋白复合物,如病毒样颗粒
  • 合成聚合物
  • 脂质体或外泌体
  • 高蛋白聚合物

使用单机MALS测量分子平均尺寸

分馏或“单机”测量可提供溶液中所有分析物含量的Z平均半径Rg,z。 通过将样品直接注入 DAWN® 或 miniDAWN® 流通池中进行单机MALS,以进行尺寸测量。 从历史上看,单机测量很费力并且容易出错。 Calypso®使单机 MALS 自动化,从而获得准确,可靠和快速的结果。


应用

单机MALS通常被用来分析:

  • 不易分离的非常大的非结构聚合物
  • 在分离时,容易被稀释或在剪切作用下可能被离解的大型蛋白质复合物
  • 易形成凝胶或粘性溶液的聚合物,它们可能堵塞管路

使用在线DLS测量分子尺寸分布

通过将WyattQELS™模块集成到DAWN、miniDAWN或microDAWN MALS检测器中,或通过将MALS检测器中收集的光通过光纤传输到单机DLS探测器(如DynaPro®NanoStar®或Mobius®)中,可以在线测量DLS。根据收集角度、激光波长和流量,在线DLS可以分析1nm ~ 250nmRh的分子。


应用

  • 量子点和金属纳米粒子由于尺寸或异常的折射率而不适进行MALS分析
  • 蛋白质和蛋白质聚合物的构象
  • 结合MALS的测量结果(Rg),判断生物高聚物和其他大分子的构象,例如区分填充和未填充脂质体药物载体

使用单机DLS测量分子尺寸

在单机模式(无流动)下,DLS可以测量0.2nm ~ 5000nm的颗粒。单机模式DLS的另一个有价值的特性是它能够通过正则化分析尺寸分布,且而无需任何分离。虽然根据单机处理DLS计算的分布只能清楚地分离半径相差约3x-5x的种群,但可以通过峰值宽度(也称为多分散性)来评估聚集体和其他形式的异质性。

  • 反复多次的分析粒径“单峰”分布的多分散性,最后取平均值为结果
  • 通过NNLS(非负最小二乘法)正则化分析,DLS可以区分大小至少相差3-5x的粒子群

尽管尺寸分辨率较低,但DLS对平均尺寸的变化相当敏感。敏感程度低至1 ~ 2%的大小变化能力被用于分析蛋白质在变温时的解链情况,通过浓度或大小的成分依赖性评估的蛋白质和蛋白质之间的相互作用,甚至脂质或寡核苷酸与纳米粒子的结合。

DynaPro NanoStar 在高质量石英比色皿或一次性塑料反应杯中提供单机处理数据光路,而DAWNminiDAWN使用比色皿适配器套件在流动池或石英 10 µL 比色皿中提供单机处理数据光路。


应用

  • 快速估算有机和无机纳米粒子的平均粒径和多分散性
  • 高聚合蛋白质表达、纯化、检测的快速质量控制
  • 齐聚或聚集状态的简单半定量评估
  • 蛋白质熔融与蛋白质相互作用研究

高通量单机DLS测量分子尺寸方法

虽然与MALS相比,DLS对低样品浓度的灵敏度较低,但它的优点在于不易受到杂散光的干扰,因此可以在不太严格的光学条件下进行。DynaPro® Plate Reader 利用这一特殊功能,在工业标准的微孔板上直接进行自动化DLS测量,每天测量数百甚至数千个样品或样品条件。


应用

  • 高通量筛选蛋白质或病毒样颗粒等生物治疗复合物的最佳配方条件
  • 根据配方条件(辅料、pH等)测定蛋白质熔化温度
  • 用扩散相互作用参数kD表征非特异性蛋白质的相互作用

使用MALS和粘度检测器测量分子尺寸分布

当聚合物太小,无法通过在线MALS直接确定尺寸分布时,将ViscoStar®microViscoStar™ 配备至SEC仪器后即可提供另一种解决方案。流体力学体积与摩尔质量和特性粘数的乘积基于Einstein-Simha的方程Vh=M[η]/(2.5NA)是直接相关的,最后流体力学半径可由流体力学体积计算得出。

由于特性粘度和摩尔质量都是在没有假设的情况下确定的,SEC-MALS-IV的测量结果提供了分子大小的绝对估计值。

MALS的应用领域

除了MALS的标准分析应用外,它还可以直接在试验工厂或制造车间用于开发、监控和控制制造过程。ultraDAWN™OBSERVER™ 软件实时测定并报告通过仪器的蛋白质或聚合物溶液的重均摩尔质量;这称为RT-MALS

部分文献

Ahmad, A.; Uversky, V. N.; Hong, D.; Fink, A. L. Early events in the fibrillation of monomeric insulin. J. Biol. Chem.  2005, 280, 42669-42675.

Aichmayer, B.; Widermann-Bidlack, F. B.; Gilow, C.; Simmer, J. P.; Yamakoshi, Y.; Emmerling, F.; Margolis, H. C.; Fratzl, P. Amelogenin nanoparticles in suspension: deviations from spherical shape and pH-dependent aggregation. Biomacromolecules  2010, 11, 369-376.

Striegel, A. M. Architecture on the mechanochemical degradation of macromolecules. J. Biochem. Bioph. Meth.  2003, 56, 117-139.

Tarazona, M. P; Saiz, E. Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules. J. Biochem. Bioph. Meth.  2003, 56, 95-116.

Wyatt, P. Submicrometer particle sizing by multiangle light scattering following fractionation. J. Colloid Interf. Sci.  1998, 197, 9-20.

文献搜索

测量尺寸的相关仪器

MALS 检测器

 dawn, molar mass determination, molar mass measurement, molar mass analysis, molecular weight measurement, molar mass characterization

DAWN® - 最灵敏的MALS探测器。配备18个角度的探测器,用以确定 200 Da ~ 1 GDa 摩尔质量和10 ~ 500 nm半径的分子。

  • 标准选项:常温型
  • 制冷/加热型:-15 ~ 150 ℃
  • 超高温型:20 ℃ ~ 210 ℃

DAWN提供了处理荧光样品的特殊信号:荧光屏蔽滤光片和785nm的红外激光。


miniDAWN®
- 3角度光散射探测器,用以测定200 Da ~ 10 MDa摩尔质量和10–50 nm半径的分子(仅限环境温度)。

microDAWN™ - 第一个为UHPLC打造的 MALS探测器,探测器间的分散度低至1.5 µL。采用3角度探测器,测定200 Da ~ 20 MDa摩尔质量和10-50 nm 半径的分子(仅限环境温度)。

Calypso® - 制备和样品输送系统以及用于在 MALS 检测器中执行和分析自动浓度或组成梯度的软件。 自动执行可靠且可重复的 Zimm 图,并在 DAWN 或 miniDAWN 中测量与时间或成分有关的样品大小。

动态光散射检测器

DynaPro NanoStar, particle size analysis, size exclusion chromatography, nanoparticle size, nanoparticle analysis

DynaPro® NanoStar® - 基于 NanoStar 比色皿的 DLS 检测器通过将其光学收集光纤安装到 Wyatt MALS 检测器中,起到了在线 DLS 检测器的双重作用。

WyattQELS™ - 将 DLS 模块集成到 DAWN,miniDAWN 或 microDAWN MALS 检测器中,可在与主要 MALS 测量相同的散射体积下同时进行 DLS 测量。

粘度检测器

ViscoStar

ViscoStar® - 是一种高度灵敏的在线粘度检测器,与SEC-MALS一起用于测定所有类型的生物大分子、合成聚合物甚至蛋白质和多肽的大小和构象。

ViscoStar采用多种新技术,为各种GPC提供最高灵敏度、稳定性和溶剂兼容性的粘度检测器。它的易用性和可维护性使其成为Wyatt's DAWN®光散射检测器和Optilab®示差检测器的完美伴侣。温度控制在4°C ~ 70°C之间。

microViscoStar™ - 与ViscoStar类似,但专门设计用于UHPLC/APC。

示差折光检测器

Optilab® - 一种独特的在线示差折光检测器,用于测量任何大分子的浓度,且不受发光基团的影响。温度可以在4°C ~ 65°C之间调节。同时,它可以测量高达180 mg/mL蛋白质溶液的浓度。

microOptilab™ - 第一个专门设计用于所有UHPLC系统的RI探测器。

单机 DLS 仪器

DynaPro Plate Reader, particle size analysis, nanoparticle size, nanoparticle analysis

DynaPro® Plate Reader - 唯一一种可在标准96、384或1536微孔板上直接测量尺寸和摩尔质量的DLS和SLS的仪器,可与移液机器人和基于多技术板的测定规程集成。 温度控制在 4°C ~ 85°C 之间。 集成的摄像头可查看每个孔,以进行故障排除和诊断。

DynaPro® NanoStar® - 样品体积小至1.25 µL,温度控制范围在 -15°C ~ + 150°C之间,超越了传统的基于比色杯的 DLS 仪器。 它提供了与 DLS 检测系统平行的优化的静态光散射检测器,以便确定真实的摩尔质量。 通过将其光学收集光纤安装到 Wyatt MALS 检测器中,NanoStar 可以充当在线 DLS 检测器的双重职责。

Mobius™ - 通过动态光散射将尺寸与电泳迁移率测量同时进行。

Calypso® -制备和样品输送系统以及用于在 MALS 检测器中执行和分析自动浓度或组成梯度的软件。 自动执行可靠且可重复的 Zimm 图,并在 DAWN 或 miniDAWN 中测量与时间或成分有关的样品大小。

microCuvette - 允许仅使用 10 µL 的石英比色皿在 DAWN 中同时进行静态和动态光散射测量。

Microbatch Kit - 用于将样品注入 MALS 检测器的流通池中。

NanoFilter Kit - 使珍贵样品的过滤,回收和再过滤变得容易。 当您的总样品量低于 300 µL 时,此功能特别有用。

场流分离系统

eclipse-dualtec, molar mass determination, molar mass measurement, molar mass analysis, molecular weight measurement, molar mass characterization

非对称流场分离系统(AF4)和中空纤维流场分离系统(HF5)可以对直径为1nm ~ 10000nm的大分子和纳米粒子进行多功能分离。结合MALS和DLS仪器,FFF分离是获得溶液中摩尔质量和分子尺寸分布的理想方法。

Eclipse® DualTec™ - Tip-injection FFF流体控制系统,它与您的高效液相色谱泵和自动进样器集成,在不丧失SEC功能的情况下提供FFF的所有优点。支持AF4、HF5和SEC中任意两个之间的切换。

Eclipse® AF4™ - Center-downstream injection FFF流体控制系统,与HF5或SEC配合使用时不需要进行优化。Fritless Channel 和 semi-preparative FFF 在使用时必需要基于AF4。

Eclipse Channels - Eclipse系统提供多种分离流道和膜,以适应各种分析甚至半制备任务。

软件

ASTRA® - 表征大分子和纳米颗粒的高端软件。用于色谱、FFF或单机处理模式下的MALS和DLS分析。ASTRA提供21CFR(11)兼容版本,并提供其他选项,如粒子分析。

DYNAMICS® - DynaPro and Mobius™ 仪器中用于单机DLS测量的软件,以及用于计算NanoStar和DynaPro Plate Reader中分子的摩尔质量和A2以及Mobius中的电泳的迁移率。同时,也用于计算分子尺寸和尺寸分布,以及导出熔化温度Tm、聚集起始温度Tagg和扩散相互作用参数kD

CALYPSO™ - CALYPSO软件控制CALYPSO组成梯度系统和MALS检测器,以测量溶液重均分子量作为浓度或缓冲条件的函数。这些测量结果被CALYPSO软件进一步分析,以确定结合常数、绝对化学计量和其他大分子相互作用的参数。

VISION - 控制Eclipse DualTec和AF4场流分离(FFF)系统。结合ASTRA进行数据收集和分析,ECLIPSE为用户又提供了一个大分子表征的解决方案。