Die Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS) bietet eine absolute Analyse von Polymeren. Fügen Sie Viskosimetrie für noch mehr Möglichkeiten hinzu.
 

Polymere

Der Bedarf an synthetischem Kautschuk während des Zweiten Weltkriegs gab den Anstoß für die ersten Forschungsanstrengungen bezüglich Theorie und Praxis der Lichtstreuung zur Charakterisierung von Makromolekülen in Lösung. Seitdem wurde die Lichtstreutechnologie von Wyatt zu den heute bekannten, leistungsstarken, robusten Instrumenten weiterentwickelt und wird auch weiterhin ständig verfeinert. Die absolute Analyse von synthetischen Polymeren zur Bestimmung von molarer Masse, Größe, Verzweigung und Konformation ist nach wie vor eine der Hauptanwendungen der Mehrwinkel-Lichtstreuung.

Proben- und Referenzpolymere mit dem gleichen hydrodynamischen Volumen eluieren gleichzeitig aus einer GPC-Säule, haben aber nicht immer die gleichen molaren Massen. SEC-MALS bestimmt die molare Masse von Polymeren unabhängig vom Elutionsvolumen.

HPLC Manager

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Absolute Molmassen & Größe

Agilent StackNur die Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS) kann die absolute Molmassen und Größen-Verteilungen von heterogenen Polymeren unabhängig von Retentionsvolumen, unabhängig von molekularen Standards und unabhängig von nicht-idealen Säuleninteraktionen bestimmen. Der Grund ist, dass MALS das Molekulargewicht und den rms-Radius (auch bekannt als Gyrationsradius) direkt aus den ersten Prinzipien heraus misst. Alles was Sie brauchen ist eine geeignete Methode zur größenbasierten Trennung, die dem Online MALS Detektor vorgeschaltet wird.

Koppeln Sie einen DAWN® MALS-Detektor und einen Optilab® Brechungsindex-Konzentrationsdetektor an Ihre Größenausschluss (SEC) oder Gelpermeations-Chromatographie (GPC), um ein absolutes SEC-MALS-Charakterisierungswerkzeug für Ihre Polymere zu schaffen. Wyatt-Detektoren lassen sich mit HPLC-Systemen aller großen Hersteller koppeln.

Für weitergehende Trennmöglichkeiten sollten Sie die Vorteile der Asymmetrischen Fluss-Feldflussfraktionierung in Verbindung mit MALS-Detektoren testen– FFF-MALS. Das Eclipse FFF System von Wyatt trennt Probenmengen vom Nanogramm- bis Milligrammbereich über Größen von 1 bis >1000 nm, ohne Scherung oder unerwünschte Säuleninteraktionen.

Verzweigungen

Das Design und die Kontrolle der Polymerverzweigung ermöglicht synthetische Materialien mit neuartigen mechanischen, thermischen und rheologischen Eigenschaften. Das zuverlässigste Mittel zur Bewertung der Verzweigung in allen Arten von Polymeren ist die Mehrwinkel-Lichtstreuung, wie sie von Prof. Stepan Podzimek in 'Branching Revealed: Characterizing Molecular Structure in Synthetic and Natural Polymers by Multi-Angle Light Scattering' (Application Note und On-Demand Webinar) beschrieben wird.

Das Verzweigungsverhältnis wird durch das Verhältnis von molarer Masse und Größe bestimmt. Beide werden gleichzeitig und unabhängig voneinander mittels Mehrwinkel-Lichtstreuung gekoppelt an Größenausschlusschromatographie (SEC-MALS) oder Feldflussfraktionierung (FFF-MALS) bestimmt. Moleküle mit einem Radius von weniger als 10 nm erfordern ein ViscoStar®-Differenzialviskosimeter zur Größenbestimmung oder ein in den MALS-Detektor eingebettetes WyattQELS-Modul für Dynamische Lichtstreuung zur Größenmessung.

linear vs branched polystyrene conformation plots

Abbildung 1. Analyse der Verzweigung durch Auswertung von Konformationsdiagramme von linearem und verzweigtem Polystyrol.

Während SEC-MALS für eine Vielzahl von Polymeren geeignet ist, bietet FFF-MALS unter Verwendung der Eclipse weitere Vorteile gegenüber SEC. Die FFF-basierte Trennung ist für bestimmte stark verzweigte Polymere, die abnormal von SEC-Säulen eluieren, zwingend erforderlich.

radius v. elution plot

Abbildung 2. RMS-Radius vs. Elutionsvolumen-Chromatogramm von Acryl-Copolymer. Die Trennung mittels SEC-MALS zeigt eine nicht-ideale Elution (nicht monoton in der molaren Masse).

branched polystyrene sec-mals and fff-mals

Abbildung 3. AF4-MALS (blau dargestellt) überwindet die nicht-ideale Elution und die nicht-idealen Konformationsdiagramme, die bei bestimmten stark verzweigten Polymeren in SEC-MALS (rot dargestellt) auftreten.

Konformation

Auch wenn das Polymer nicht verzweigt ist, sind Informationen über die Konformation im Verhältnis zwischen molarer Masse und Größe bzw. zwischen dem Verhältnis von rms-Radius Rg und hydrodynamischem Radius Rh verfügbar.

Abbildung 4. Polystyrol, PMMA, Zellulosestäbchen und Hyaluronsäure weisen unterschiedliche Steigungen auf, die den verschiedenen Konformationen entsprechen.

Abbildung 5. Theoretische Beziehung zwischen Masse und Radius für verschiedene Konformationen.

Copolymer-Analytik

Co-Polymere sind im Allgemeinen nicht für die Standard-GPC Analyse geeignet, da keine Referenzstandards zur Kalibrierung der Elutionszeit in Abhängigkeit von der molaren Masse zur Verfügung stehen. Selbst mit Standard-SEC-MALS ist es schwierig, heterogene Verteilungen von Co-Polymeren zu analysieren, da im Allgemeinen das dn/dc, welches die von der chemischen Zusammensetzung, aber nicht von der Struktur des Polymers abhängt und ein notwendiger Parameter in der MALS-Analyse ist unvorhersehbar über das Chromatogramm variiert.

Es ist jedoch möglich, die Co-Polymer-Analyse über ein Dreifach-Detektionssystem durchzuführen: SEC + UV-MALS-RI, oder in einigen Fällen SEC + NIR-MALS-RI, wenn die beiden Polymerkomponenten signifikant unterschiedliche Verhalten in den beiden Konzentrationssignale zeigen. In diesem Fall erfasst die ASTRA®-Software Konzentrationsdaten von zwei verschiedenen Konzentrationsdetektoren (Ultraviolett UV + Brechungsindex RI oder Nahinfrarot NIR + RI). RI wird über ein Optilab-Differenzialrefraktometer, MALS wird über einen DAWN Mehrwinkel-Lichtstreudetektor und UV bzw. NIR über Online-Detektoren von Drittanbietern gemessen.

Abbildung 1. Diagramm des Styrolanteils als Funktion der molaren Masse für Copolymere aus Styrol-Butylacrylat, die durch Emulsionspolymerisation hergestellt wurden. Der eingesetzte Styrolanteil war: 23 % (blau), 48 % (grün) und 73 % (rot).

Bei bekanntem Einfluss des Polymers auf die Konzentrationsmessungen ist es möglich, das Verhältnis der Konzentrationen der beiden Komponenten zu berechnen. Diese Information wird mit dem MALS-Signal kombiniert, um die molare Masse jeder Komponente im Komplex zu bestimmen. Somit liefert diese Analyse zu jedem Elutionszeitpunkt die Gesamtmolmasse sowie die molaren Massen der einzelnen Bestandteile im Co-Polymer.

Messungen ohne Trennung: Zimm Plots

Zimm PlotEinige Polymere sind zu empfindlich, um ohne Degradation durch eine GPC-Säule zu laufen, z. B. ein Makroligand, der von labilen Metallen dissoziieren wird. Andere, wie z. B. große PMMA-Moleküle, können zu groß für GPC sein. Diese Materialien können immer noch mittels Batch-MALS charakterisiert werden, wobei sie gewichtsgemittelte molare Masse Mw und der Z-gemittelte rms-Radius rg,z bestimmt werden. Die genaue Bestimmung dieser Werte erfordert eine "Zimm-Plot"-Analyse, d. h. eine Messung der Lichtstreuintensität als Funktion des Winkels und der Konzentration, ohne Trennung.

Die traditionelle Methode zur Erstellung von Zimm-Plots beinhaltet die manuelle Herstellung einer Serie von Proben mit steigenden Konzentrationen. Batch-MALS-Messungen werden in einem Szintillationsfläschchen unter Verwendung des Batch Kits durchgeführt. Alternativ werden bei der Microbatch-Methode die Konzentrationen in die MALS-Flusszelle mittels Spritze injiziert. In beiden Fällen analysiert die ASTRA-Software die Daten über einen globalen Fit aller Winkel und Konzentrationen mit einer einzigen Lichtstreugleichung. Die Ergebnisse umfassen Mw, Rg,z und den zweiten Virialkoeffizienten A2, der die Wechselwirkungen zwischen Probe-Probe und Probe-Lösungsmittel beschreibt.

Bequeme Methoden zur Erstellung von Zimm-Plots nutzen Automatisierung, um die Verdünnungen aus der Stammlösung zu erstellen und die Proben in die MALS- und RI-Durchflusszellen zu injizieren. Die Konzentrations- und Lichtstreuungsdaten werden in diesem Fall automatisch erfasst und die drei Parameter berechnet. Diese Automatisierung kann mit dem Calypso® Composition-Gradient-System oder durch die Verwendung eines Autosamplers mit einer großen Injektionsschleife erfolgen.

dn/dc Bestimmung

Das Brechungsindexinkrement dn/dc beschreibt die Änderung des Brechungsindex einer Lösung mit der Konzentration des Analyten. Es gibt mindestens drei Gründe für die Messung von dn/dc einer Polymerprobe:

  • Um ein Differentialrefraktometer zur Online-Konzentrationsmessung mit GPC zu verwenden, d.h. um einen unbekannten dn/dc zu bestimmen
  • Die Analyse von MALS-Daten erfordert die Kenntnis von dn/dc bei der MALS-Wellenlänge
  • Um den Anteil jedes Monomers in einer Co-Polymerlösung abzuschätzen, wenn sich die dn/dc-Werte der beiden Monomere signifikant unterscheiden

Manuelle dn/dc Messungen können mit dem Optilab-Differenzialrefraktometer mit Hilfe des WISH Injektionsmoduls durchgeführt werden. Automatisierte Messungen können durch Kombination des Optilab mit einem Calypso ermöglicht werden. Bei geladenem Polymer ist oft eine Dialyse mit dem gewünschten Eluenten erforderlich, da auch die Gegenionen ein Signal im Brechungsindexdetektor verursachen.

SEC-IV und Universelle Kalibrierung

SEC-IV nutzt die intrinsische Viskosität (IV) und empirisch ermittelte Mark-Houwink-Parameter zur Bestimmung der molaren Massen von Polymeren. Die Mark-Houwink-Parameter hängen vom Polymer, dem Lösungsmittel und der Konformation ab..

Neben der SEC-MALS Methode wird seltener auch die Universelle Kalibrierung (UC) für die Bestimmung von Molekulargewichten von linearen Polymeren verwendet. UC bestimmt das hydrodynamische Volumen aus der Retentionszeit und berechnet die molare Masse bei jedem Elutionsvolumen aus dem Verhältnis von hydrodynamischem Volumen und intrinsischer Viskosität (diese Analyse ist weniger genau als SEC-MALS, da sie die Möglichkeit nicht-idealer Wechselwirkungen zwischen Probe und Säule nicht berücksichtigt und mit der mobilen Phase kompatible Referenzstandards erfordert).

Das ViscoStar Online-Differenzialviskosimeter und das Optilab Differenzialrefraktometer arbeiten zusammen mit der ASTRA-Software um Molmassen- und intrinsische Viskositätsverteilungen einer Polymerprobe mit Hilfe von SEC-IV oder UC zu analysieren.

Diese Techniken sind besonders nützlich, wenn die Brechungsindizes des Polymers und des Lösungsmittels sehr ähnlich sind, so dass das Polymer im Wesentlichen unsichtbar ist, da es keine nennenswerten Mengen an Licht streut (dn/dc~0) und wenn die Polymere zu stark fluoreszieren für den MALS-Detektor.


Messung der Mark-Houwink-Parameter

Die Beziehung zwischen der molaren Masse und der intrinsischen Viskosität, die auf die molekulare Konformation hinweist, wird durch den Mark-Houwink-Parameter beschrieben. Dieser Wert kann auf zwei Arten ermittelt werden:

  1. auf rein viskosimetrische Weise, wobei UC zur Charakterisierung sowohl der molaren Masse als auch der intrinsischen Viskosität verwendet wird.
  2. durch SEC MALS-IV-RI, wobei die molare Masse durch die Kombination eines DAWN MALS-Detektors und Optilab bestimmt wird, während die intrinsische Viskosität mit dem ViscoStar und Optilab ermittelt wird. Die Analyse wird in der ASTRA-Software durchgeführt.

Kinetik von Polymerisation und Abbau

Da die Intensität des Streulichtes direkt proportional zur molaren Masse ist, ist sie ein hervorragendes Mittel zur Überwachung des Verlaufs einer Polymerisation. Die Winkelabhängigkeit der Mehrwinkel-Lichtstreuung zeigt die Größe für zusätzliche Diagnosen an und die Dynamische Lichtstreuung kann zur weiteren Charakterisierung einbezogen werden.

Wenn Reaktionszeitskalen deutlich länger sind als die Zeit, die für eine Trennung benötigt wird (typischerweise 30 Minuten), ist das ideale Mittel zur Charakterisierung des Polymerisationsprozesses die regelmäßige Entnahme von Aliquots aus dem Reaktionsgefäß und die Analyse mittels SEC-MALS. Reaktionen über kürzere Zeiträume müssen notwendigerweise im Batch-Modus (unfraktioniert) ausgewertet werden, was Durchschnittswerte für molare Massen und Größen anstelle von vollständigen Verteilungen liefert. Das Calypso-System ist ein bequemes Mittel zur Vorbereitung, zum Mischen und zur Injektion von Mehrkomponentenlösungen in ein MALS-System wie das DAWN.

Holz, Zellstoff und Papierprodukte

Eine interessante analytische Herausforderung stellen die Biopolymere aus Holzzellstoff und ähnlichen natürlichen Quellen dar.

Lignine

Lignine neigen dazu Laserlicht zu absorbieren und zu fluoreszieren. Beide Phänomene führen zu fehlerhafter Bestimmung der molaren Masse und Größe, es sei denn, Instrumente und Software können diese Fehlerquellen überwinden. Das DAWN bietet einen optionalen Infrarotlaser sowie optische Filter, um sowohl die Gesamtfluoreszenz als auch die Menge, die die Detektoren erreicht, zu minimieren. Darüber hinaus misst der "Forward Monitor"-Detektor im DAWN die Laserabsorption durch die Probe, damit die ASTRA-Software die gemessene molaren Masse korrigieren kann.

Zellulose

Cellulose bildet große, stäbchenförmige Nanokristalle. Diese können zwar von der Standard-GPC nicht erfasst werden, lassen sich aber mit dem Eclipse Feldflussfraktionierungs-System leicht abtrennen und anschließend mit einem DAWN und bei Bedarf mit dem integrierten WyattQELS Modul für Dynamische Lichtstreuung messen. Die Form der Nanokristalle wird anhand der Abhängigkeit der molaren Masse von der Größe beurteilt und dann in die Analyse zurückgeführt, um die Genauigkeit der Massen- und Größenverteilungen zu verfeinern.

Heparin

Als wichtiger Bestandteil der Blutgerinnungskette muss Heparin sorgfältig und vollständig charakterisiert werden. Die Lichtstreuung bietet dazu mehrere Methoden an:

Hydroxyethyl-Stärke (HES)

HES ist ein Blutersatzmittel auf Polysaccharidbasis, das aus Mais- und Kartoffelrohstoffen hergestellt wird. Die beiden Ausgangssubstanzen führen zu HES mit unterschiedlichen Konformationen, die sich aus unterschiedlichen Verzweigungsgraden ergeben. SEC-MALS bestimmt nicht nur das genaue Molekulargewicht unabhängig von der Konformation, sondern quantifiziert auch das Konformations- und Verzweigungsverhältnis für ein tieferes Verständnis der beiden HES-Prozesse. Wie von Karyakin et al., beschrieben, ist SEC-MALS ein wesentlicher Bestandteil der HES-Qualitätskontrolle.

Biologischer Abbau

Die Lichtstreuung ist ein hervorragendes Mittel zur Beurteilung des Abbaus von Biopolymeren als Folge der Einwirkung von Hitze, Licht, hohem oder niedrigem pH-Wert und anderen Verfahren.

Aggregation und Fragmentierung

Einige häufige Formen des biologischen Abbaus sind Aggregation und Fragmentierung, die beide leicht mit hohem Informationsgehalt über SEC-MALS charakterisiert werden können. Dazu wird eine Biopolymerprobe vor und nach der Einwirkung von Umwelteinflüssen oder chemischem Stress auf eine entsprechende GPC-Säule injiziert und anschließend von MALS und dRI-Detektion charakterisiert. Die Analyse kann mehrere Messwerte zur Quantifizierung des Abbaus liefern, z. B. Verschiebungen in Mn, Mw und Mz, die die zahlen-, gewichts- bzw. z-gemittelten Molmassen der Probe darstellen. Der biologische Abbau kann auch zu Änderungen der molekularen Konformation führen, die in SEC-MALS durch das Verhältnis von rms-Radius Rg zur molaren Masse angezeigt werden.

Partikelbildung

Eine weitere Möglichkeit des biologischen Abbaus ist die Bildung oder Dissoziation von Partikeln. Für eine schnelle Bewertung von Nanopartikelpopulationen ist DLS ideal, da sie nur wenig Probe und sehr wenig Zeit für Vorbereitung und Messung benötigt. Während die Größe von monodispersen Partikeln mit DLS genau gemessen werden kann, sind Größenverteilungen eher qualitativ als quantitativ. Eine gründlichere Analyse bietet FFF-MALS, die sowohl lösliche als auch unlösliche Komponenten mit hervorragender Auflösung trennt, die dann mit dem nachgeschaltetem Lichtstreudetektor analysiert werden können.

Kinetik

Während sich sehr langsame Prozesse durch periodische Probenahmen aus einem Reaktionsgefäß mit SEC-MALS analysieren lassen, bieten Batch-MALS, Batch-DLS und CG-MALS alternative Ansätze zur Analyse der Kinetik schnellerer Reaktionen.

Wenn zwischen dem Starten der Reaktion und dem Mischen und Pipettieren in eine Küvette genügend Zeit verbleibt, können Batch-MALS oder Batch-DLS gut geeignet sein. Das Calypso kann dies automatisch mit einer Totzeit von nur wenigen Sekunden durchführen.

Application Notes

WP1003: Branching revealed: Characterizing molecular structure in synthetic polymers by multi-angle light scattering
Dieses White Paper gibt einen kurzen Überblick über die Grundlagen der Detektion und Charakterisierung von Polymerverzweigungen mittels Mehrwinkel-Lichtstreuung. SEC-MALS ist am besten für kleine und intermediäre Polymere geeignet, während AF4-MALS eine überlegene Trennung und Charakterisierung von großen und stark verzweigten Makromolekülen ermöglicht.

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WP2303: Lignin and lignosulfonate characterization with SEC-MALS and FFF-MALS
Die Lignin- und Lignosulfonat-Analyse gehört zu den anspruchsvollsten Anwendungen von SEC-MALS und FFF-MALS. Dieses White Paper zeigt die erfolgreiche Charakterisierung ihrer absoluten Molmassenverteilungen mittels FFF-MALS, unterstützt durch die fortschrittlichen technischen Eigenschaften von DAWN und Eclipse.

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AN1301: Characterization of PLGA using SEC-MALS-IV
Verzweigungen werden genutzt, um die pharmakokinetischen, biologisch abbaubaren und mechanischen Eigenschaften von PLGA zu definieren. Die Charakterisierung von verzweigtem PLGA durch konventionelle Größenausschlusschromatographie (GPC/SEC) leidet unter dem Mangel an geeigneten Kalibrierstandards. Für diese Application Note wurden PLGA-Proben mittels SEC-MALS-IV analysiert, um absolute Molmassenverteilungen und Konformationen zu bestimmen, ohne dass eine Säulenkalibrierung erforderlich war.

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AN1302: Characterization of hyaluronic acid with online multi-angle light scattering and differential viscometry
Das physiochemische Verhalten von Hyaluronsäure (HA) ist eng mit Materialeigenschaften wie dem gewichtsmittleren Molekulargewicht, der Polydispersität, der intrinsischen Viskosität und der Molekülkonformation verbunden. Diese Application Note zeigt die Analyse von HA aus einer Vielzahl von Quellen durch Differentialviskosimetrie in Kombination mit SEC-MALS. Dies führt zu einem detaillierten Verständnis dieser Eigenschaften und erklärt, warum die probengemittelten Literaturwerte so unterschiedlich sind.

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WP1004: Absolute characterization of polymers with light scattering and UHP‐SEC
UHP-SEC bietet zahlreiche Vorteile für die Charakterisierung synthetischer Polymere, ist aber empfindlicher gegenüber Säulenkalibrierungsfehlern und Drift als die traditionelle SEC. Dieses White Paper zeigt, wie UHP-SEC-MALS genau und zuverlässig die molare Masse, die Größe und die Konformation von Polymeren im Bereich von Hunderten bis Millionen g/mol bestimmt und das bei hoher Auflösung, Empfindlichkeit und geringem Lösungsmittelverbrauch.

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AN1005: Identifying short-chain branched polymers with conformational analysis
Diese Application Note beschreibt die Unterscheidung zwischen lang- und kurzkettiger Verzweigung und zeigt die Charakterisierung von Kurzketten-Verzweigung am Beispiel eines Silikonpolymers.

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 WEITERE BIOPOLYMER ANWENDUNGEN

 WEITERE SYNTHETISCHE POLYMER ANWENDUNGEN