FFF-MALS

FFF-MALS: 大分子和纳米颗粒的高级分离和表征

FFF-MALS是一种强大的方法,用于分离和表征尺寸在1 nm到1000 nm之间的所有类型的分析物,例如:

  • 基因载体、病毒和纳米药物载体
  • 蛋白质、聚集体
  • 高分子量或标准聚合物
  • 纳米塑料和金属示踪纳米颗粒

通过FFF-MALS,您可以可靠地高分辨率地确定尺寸分布和其他物理特性,这些物理特性对纳米世界的研究、开发、生产和质量控制至关重要。

fff-mals


什么是FFF-MALS?

场流分离(FFF)是一种独特的按粒径分离大分子和纳米颗粒的方法。FFF的力量在于它的基本可调性:简单地通过改变流速,一个单一的分离通道可以用来探索绝大部分尺寸范围内的分子、粒子和乳液组成的复杂样品且分辨率极高。

但分离只是解决问题的一半。对于全面的表征,一个Eclipse™ FFF 系统与DAWN®在线多角度光散射(MALS)仪器以及动态光散射(DLS)、示差检测器和UV/Vis检测器耦合,以分析:

  • 大小
  • 摩尔质量
  • 质量浓度
  • 颗粒浓度
  • 构象
  • 成分和粒子有效载荷

很明显,FFF比排阻色谱法提供了更大的范围,根据扩散系数,FFF确实与SEC两种分离方式有一些相似之处,但FFF不使用固定相。分析物不会受到剪切或高压影响。除了在线分析外,还可以收集粒级以进行额外的离线表征。

fff-mals

FFF分离混合物或颗粒且分辨率极佳。根据峰中所有洗脱组分的大小计算每个群体的平均大小和异质性。


为什么选择FFF-MALS?

纳米颗粒

FFF-MALS是纳米颗粒的唯一分析技术,具有许多优点:

  • 高分辨率分离以实现详细的表征
  • 多种在线检测模式,包括光谱和多种类型的光散射,用于综合表征
  • 非破坏性,能够回收部分样品进行进一步的离线分析,例如成像
  • 半制备分离也可用。FFF适用于从纳克到毫克的分析和半制备刻度

fff-mals

FFF-MALS-DLS分离全血清,血清白蛋白,IgG和各种类型脂蛋白的峰明显不同,大小在3 nm至300 nm之间。


大分子

对于HMW聚合物和大型蛋白质聚集体等大分子,当分析物的大小范围和复杂性超过SEC的能力时,FFF-MALS必不可少。在这种情况下,SEC-MALS不适用于绝对表征。

  • 由于FFF不像SEC一样受到尺寸的限制,因此其分离的上限远远超出了排阻色谱柱的上限。
  • 大分子和复合物不会被过滤掉,没有填充柱的情况下剪切力很小,因此保留了脆弱的结构。
  • 在高支链HMW聚合物中常见的锚固效应在FFF分离中不会发生。

而且,分离力,分离范围和分离度可通过调节流量比来简单地调节,而色谱柱则没有可调节的参数。这意味着单个FFF通道可以覆盖SEC需要多列的范围。

fff-mals

高分子量蛋白-多糖共轭物(PPC)的SEC和FFF分离,分子量范围跨越四个数量级。用SEC色谱柱除去〜107 g / mol以上的组分。 SEC分离也表现出锚定作用。 FFF提供了这种大偶联物的近乎理想的分离结果,可进行准确的MALS分析。


谁在使用FFF-MALS?

FFF-MALS用于分析大范围的复杂样品:

  • 生物制药科学家,用于表征基因疗法,疫苗和生物制剂(例如单克隆抗体)的特性和工艺
  • 制药技术人员,用于开发纳米药物输送系统,例如脂质体制剂,纳米晶体和聚合物控释颗粒
  • 分子生物学和纳米医学研究人员,用于细胞外囊泡的分离,新药和基因递送研究
  • 聚合物分析化学家 ,用于表征淀粉,透明质酸,橡胶,木质素,纤维素和高端乳胶颗粒
  • 环境科学家 ,研究环境中纳米塑料,示踪剂颗粒和有毒物质的胶体运输
  • 纳米粒子工程师的新颖应用
  • 食品和饮料开发商 ,了解并改善粘度增强剂,食品添加剂,蛋白质和生物聚合物

fff-mals


Eclipse / DAWN FFF-MALS系统

FFF-MALS将Eclipse场流分离系统(包括Eclipse FFF仪器,安捷伦的泵和自动进样器前端)与DAWN多角度光散射仪和其他在线检测器模块结合在一起。

VISION软件可用于FFF的各个方面,而ASTRA软件可获取并分析检测器信号。

fff-mals


FFF-MALS如何工作?

FFF-MALS中的分离通常通过不对称流场流分离(AF4)实现,这是迄今为止场流分馏(FFF)最普遍的形式。 FFF利用开放式通道,因此具有较大的尺寸范围和多功能性。 由于分析物根据流体动力学大小分离,因此洗脱级分通常非常均匀。

分离后,洗脱级由一个或多个检测器进行测量,这些检测器包括MALS,动态光散射(DLS),UV / Vis吸光度,示差折光检测器(dRI)和/或荧光检测器。

fff-mals


FFF的工作原理

AF4的原理如下图所示。通过应用两种流动流:通道流和错流,在带状细通道中实现高分辨率分离。

 


fff-mals

FFF分离是由逆流作用的粒子扩散驱动的,该粒子流将其集中到通道底部的膜上。相对而言,较小的粒子在通道中较高,在较高的路径中它们会更快地迁移。


通道流与膜和玻璃料平行运行。因为通道高度仅为几百微米,所以流动是层流的,从而形成了抛物线流动轮廓。样本越靠近通道中心,被抛出通道的速度就越快。

交错流垂直于半多孔(超滤)膜,该膜的孔总是小于样品粒径,并由玻璃料支撑。横流充当力场,将样品集中在底壁上。

布朗运动表示逆流作用的反作用力。较小的颗粒逆向流扩散更广,比较大的颗粒更靠近通道中心。

弛豫是FFF步骤,其中在横流和扩散之间建立平衡,从而导致进入通道的指数浓度分布。膜上方的平均高度取决于样品的扩散系数。

在洗脱步骤中,样品成分在膜上方的不同平均高度会导致朝向通道出口的不同纵向运输速度。较小的颗粒或大分子将首先洗脱,然后是较大的组分。

可以在FFF 理论页面上找到更多详细信息,例如:FFF分离过程的动画视频以及有关FFF电流的信息等。

fff-mals

通过在保留时间tR,通道高度w,错流Fx,通道流Fch和颗粒扩散系数Dt之间的简单关系来描述在恒定的错流与通道流比率下的FFF分离。


电/非对称流FFF(EAF4)

EAF4与标准AF4相似,只是增加了两个电极。在电极上施加电压会根据粒子的电荷或zeta电势改变膜上方的粒子分布,并相应地改变保留时间。

为了分析zeta电势,在至少两个不同的施加电场(其中一个通常为零强度)下测量保留时间的变化。

可以在FFF 理论页面上找到其他详细信息,包括FFF分离过程的动画视频以及有关电/非对称流FFF的信息。

fff-mals

EAF4确定混合物中每种粒径的电泳迁移率和zeta电位。


MALS和其他FFF检测技术

分离后,可以使用各种下游检测器来表征每个大小部分(与特定保留时间无关):

MALS

当每种成分通过检测器时,大约每秒钟测量一次其浓度和光散射特性。 MALS检测器包含18个光电二极管,这些光电二极管相对于激光束以不同角度θ定位,以便测量散射光。在每个数据点处,拟合散射强度与角度的关系图,以确定R(0)(角度θ= 0处的y相交)和角度拟合函数的系数。

  • 大分子:摩尔质量MR(0)与浓度之比计算得出;旋转半径Rg是根据角度拟合多项式中的一阶项计算得出的。
  • 纳米粒子:虽然角度数据也可能适合确定纳米粒子的Rg,但更常见的是选择形状模型,例如用于纳米粒子的均匀球体,涂层球体或棒。这些配合可提供几何尺寸,例如半径或杆长。颗粒浓度由R(0) 和颗粒尺寸,例如半径。

有关 MALS理论的更多详细信息,请参见我们的MALS理论页面。

DLS

动态光散射检测器在微秒和毫秒的时间尺度上测量光散射信号的波动率。由于这些波动是由布朗运动引起的,因此可以对其进行分析以确定扩散系数和流体动力学半径Rh。有关其他详细信息,请参见DLS理论页面。

与普通单机DLS相比,FFF-DLS通过分离为每个时间片中测得的均相馏分而提供了更高的分辨率。

fff-mals

在MALS中,散射光是通过围绕分析物以多个角度放置的检测器进行测量的。拟合散射强度与角度的关系图,以确定R(0)(在角度θ= 0处的y相交)和角度拟合函数的系数。摩尔质量和颗粒浓度从R(0)计算,尺寸从角度拟合计算。


其他检测模式

FFF-MALS结合其他检测器:

  • UV / Vis或示差(dRI)检测器与MALS结合使用,可计算纯蛋白质或聚合物的摩尔质量。
  • dRI可以与UV / Vis和MALS结合使用,以分析共轭分子,例如糖缀合物,蛋白质-核酸复合物或共聚物。
  • UV / Vis可以用荧光检测器代替非常低浓度的标记分子。
  • ICP-MS用于金属和矿物纳米颗粒的元素分析;单颗粒ICP-MS用于计数此类颗粒,同时根据组成对其进行分类。

fff-mals

MALS,UV和dRI的组合分析了共轭大分子(例如这种AAV病毒)的含量,该大分子包含蛋白质衣壳和DNA有效负载。


什么构成完整的FFF-MALS系统?

初级

分离系统

FFF-MALS的FFF部分处理分离,包括Eclipse FFF仪器和分离通道,以及一个泵和一个自动进样器。

  • Eclipse仪器可调节通道,交叉和进样流速。它还测量各种流量和压力,以便不断评估性能并在出现任何问题时提供反馈。
  • 短通道是最常用的分析FFF通道。
  • Agilent 1260四元泵和自动进样器用作液体处理前端。支持其他安捷伦泵和自动进样器。
  • VISION软件控制整个FFF系统。 VISION还用于计算机方法设计以及流量和紫外线信号的采集分析。

检测系统

基本的FFF-MALS系统包括DAWN MALS仪器和UV或dRI检测器。

  • DAWN有18个角度检测器;它的摩尔质量检测范围为200-109 g / mol,检测分子半径为10-500 nm。
  • 为了分析不包含可靠已知生色团的聚合物,脂质纳米颗粒和其他分析物,需要使用Optilab dRI检测器。
  • 为了分析蛋白质和其他吸收紫外线的分析物(包括病毒),建议使用Agilent 1260 VWD,MWD或DAD。可以从MWD和DAD获取多波长数据以进行其他分析。
  • ASTRA软件获取并分析MALS和浓度数据以及DLS数据。

fff-mals


高级

几种高级FFF选项:

  • SEC切换选项:在FFF通道和SEC列之间自动切换整个系统,包括检测器。
  • 稀释控制模块:DCM减少了之间的洗脱样品稀释量1-10x,同时提供极其精确的检测器流速。这样可以提高灵敏度,可重复性,馏分收集和DLS测量范围。
  • Eclipse Mobility: Mobility附加组件实现电流FFF,以便测量样品组件的Zeta电位。
  • 其他流道:
    • 长通道可用于标准分析FFF中,以增加样品负载,并通过较低的错流减少剪切力和膜相互作用
    • 分散入口通道消除了聚焦步骤,可更好地分离易于聚集的样品
    • 半制备通道分离毫克量样品
  • 馏分收集器:可以添加VISION并控制Agilent 1260馏分收集器。

可以添加其他检测模式以进行更全面的分析:

  • DLS模块:提供无法通过MALS测量的颗粒的尺寸:半径小于10 nm,金属纳米颗粒小于〜100 nm。 MALS和DLS的结合可告知颗粒的形状和结构。 DLS可以添加为嵌入DAWN的WyattQELS模块,也可以添加为DynaPro NanoStar或ZetaStar独立仪器,该仪器通过光纤连接到DAWN流通池。
  • 双浓度检测器:紫外光和dRI的组合用于确定结合分子的含量,例如蛋白质-多糖结合物或病毒载体。
  • 荧光:Agilent 1260荧光检测器可用于根据化学成分或标记物识别颗粒,以及检测痕量的某些分子。

fff-mals

稀释控制模块可将检测器的浓度提高10倍至5倍,而不会显着降低分辨率。此处显示:BSA单体和二聚体。


fff-mals


Eclipse FFF-MALS系统有何独特之处?

  • 性能:就分离度,分离范围和灵敏度而言,是市场上最好的
  • 结果:对MALS和DLS数据进行强大,全面的分析
  • 软件辅助方法开发:消除了费力的反复试验方法开发
  • 易于使用:单击鼠标即可启动序列。 其他一切,包括系统监视和数据收集都是完全自动化的。
  • 生产率:系统监视器和运行状况指示器确保每次运行的样品都能产生最佳数据。 通过预防性维护提醒减少停机时间。
  • 智能溶剂管理:减少缓冲液消耗,因此您可以通过扩展序列运行更多样品

fff-mals


FFF-MALS的关键应用

FFF-MALS在工业和研究机构中有许多应用。 可以使用FFF-MALS分析亚微米范围内溶液或悬浮液中的每种复杂样品。 在下面,您将找到每个领域的精选应用笔记和按需在线研讨会。 可搜索的文献包含数千篇引用Wyatt仪器的同行评审文章的参考文献,是研究特定FFF-MALS应用程序的绝佳资源。

疫苗,基因载体和细胞外囊泡

基因载体的表征

通过结合SEC和FFF的MALS定量分析基因载体的多种特征:同一性,纯度,均一性,核酸含量,颗粒浓度,空满比等。这种表征的范围和深度正在迅速扩大。

通过观看网络研讨会,了解FFF-MALS以及SEC-MALS和DLS如何量化基因载体的关键质量属性,用光散射定量病毒载体的属性

fff-mals


小型病毒载体和病毒样颗粒

小型病毒载体和VLP可以通过SEC-MALS进行分离和分析,以评估身份,含量,颗粒浓度和聚集。但是,某些VLP绑定到SEC色谱柱,需要使用其他分离技术– FFF可以满足要求。另外,大型聚集体可能会被色谱柱滤除或破坏,这需要诸如FFF之类的技术,该技术不能过滤或剪切这些物质。

AN2003中报道了AAV聚集体的扩展表征,通过FFF-MALS量化AAV聚合和CQA

fff-mals

AN2003中的AAV聚合的FFF-MALS分析


细胞外囊泡-分离与表征

尽管用FFF-MALS-DLS获得准确,高分辨率的尺寸分布在电动汽车研究中很重要,但将电动汽车与杂质分离并收集基于尺寸的馏分进行离线分析的能力非常宝贵。对这些级分的分析导致发现了三个基本外泌体群体:大外泌体,小外泌体和外泌体。

有关EV分离,表征和隔离的介绍,请参见WP2606:通过FFF-MALS-DLS进行外泌体鉴定

fff-mals

WP2606中的细胞外囊泡的FFF-MALS-DLS分析


疫苗的表征

FFF-MALS和其他光散射技术已广泛用于表征疫苗制剂,例如病毒,病毒样颗粒,mRNA或DNA载体,多糖和蛋白质-多糖缀合物。

有关此主题的关键出版物列表可从以下链接获得:PL9006:有关具有多角度和动态光散射的疫苗特性的主要出版物。 网络研讨会也对此主题进行了研究,详见: 通过光散射技术进行生物物理表征,PAT和质量控制

fff-mals


同行评审出版物

FFF-MALS被认为是表征病毒和非病毒基因载体所必需的。

有关此主题的关键出版物列表可从以下链接获得: PL2609:FFF-MALS-DLS nanoDDS关键出版物




 更多的生物治疗应用

 双治疗性特征网络研讨会

fff-mals


纳米药物

FFF-MALS表征纳米药物的简介

FFF-MALS是一种用于纳米药物表征的强大技术,因为它可以量化详细的粒度分布,颗粒浓度,形状和含量。

WP2611:具有场流分级分离和光散射的纳米药物表征(FFF-MALS-DLS)中概述了FFF-MALS用于分离和表征纳米药物的原理。

fff-mals

WP2611中讨论了颗粒形状的FFF-MALS分析。


脂质纳米颗粒药物制剂

开发和商业化基于纳米颗粒的新型疗法的主要挑战之一是制剂成分的详细表征。 FFF-DLS-MALS技术将光散射和其他在线检测器与场流分级分离相结合,即使在血清中也能应对这一挑战。该技术适合满足FDA对脂质体制剂分析的要求。

网络研讨会:脂质纳米颗粒药物制剂的表征用于案例研究,包括测量详细的脂质体大小分布,评估药物释放和转移至细胞膜代理;颗粒形态,共存胶体结构的定量;和纳米载体的稳定性。

fff-mals


用于药物递送的聚合物

表征聚合物和聚合物小体结构的能力以及它们在药物封装方面的性能,对于开发针对治疗任务精心定制的新型药物递送方式至关重要。

在网络研讨会上了解FFF-MALS如何定量自由结合的药物以及聚合物结构和多聚体大小分布,复杂(生物)大分子体系结构的分离和表征

fff-mals

FF2611的FFF-MALS分析。图由Albena Lederer提供。


同行评审出版物

FFF-MALS被认为是表征纳米制剂药物必不可少的。

关于此主题的关键出版物的列表可以访问:PL2609:FFF-MALS-DLS nanoDDS关键出版物




 更多纳米颗粒应用

 纳米颗粒表征网络

 


蛋白质类

蛋白质聚集体

光散射提供了一系列互补技术,用于表征治疗性蛋白质(如单克隆抗体)的不可逆和可逆聚集。这些包括FFF-MALS以及SEC-MALS,CG-MALS和动态光散射。

通过光散射进行互补分析和正交分析中了解这些技术如何提供mAb聚合的完整图片。


蛋白质-多糖结合物

复杂的异质样本(例如蛋白质-多糖缀合物疫苗)的大小分析可能非常具有挑战性。完全表征不仅需要摩尔质量和尺寸分布,还需要共轭比。

疫苗:蛋白质-多糖结合物中,已开发出一种FFF-MALS方法,用于将58 kDa的蛋白质与200至500 kDa范围内的多糖偶联,并将结果与​​其他技术相比。

fff-mals

蛋白质聚集体的FFF-MALS分析。


Host-guest 化学

Host-guest 化学通过非共价相互作用将空心化合物(主体)与一个或多个显示识别部分(客体)的分子结合。形成的复合物在表征分析过程中可能会出现稳定性问题。

FFF-MALS在分离过程中保持高浓度的能力,从而避免了结合物的解离并测量了复杂的化学计量,这在AN2001中进行了介绍:化学计量和宿主-客体蛋白质-肽复合物的稳定性

fff-mals

AN2001中具有host-guest系统。


交联蛋白

乳蛋白的酶促交联可增强发酵乳制品的质地和物理特性。大小和分子形状在最佳凝胶网络的形成中起主要作用,但是通过标准分离技术(例如大小排阻色谱法或凝胶电泳)确定大小非常具有挑战性。

AN2002:使用FFF-MALS表征酶联交联的酪蛋白,以FFF-MALS分离和表征交联的酪蛋白的摩尔质量和构象。




 更多蛋白质应用

 蛋白质表征网络研讨会

fff-mals

AN2002中酪蛋白构象的交联时间依赖性。


生物聚合物和合成聚合物

摩尔质量,大小和支化度的绝对分析

尽管对凝胶渗透(GPC)或体积排阻色谱(SEC)进行常规校准非常有用,但这种类型的分析存在固有的缺点,会带来实验误差。多角度光散射(MALS)检测非常易于使用,可以帮助克服常规基于校准的方法所面临的挑战。

用于绝对聚合物表征的光散射中,了解MALS的基础知识及其在聚合物表征中的应用。

fff-mals


分支分析

长链支化是影响聚合物材料性能的最重要特征之一。 SEC-MALS和SEC-MALS-IV最适合中小型聚合物,而FFF-MALS可对大型和高度支化的大分子进行出色的分离和表征。

The theory and applications of light scattering and differential viscometry in branching analysis are examined in WP1003:通过多角度光散射表征合成聚合物中的分子结构中考察了光散射和微分粘度计在分支分析中的理论和应用。在网络研讨会中也有相关研究:通过多角度光散射表征合成和天然聚合物的分子结构

fff-mals

WP1003的聚合物支化分析。


木质素和木质素磺酸盐

木质素和木质素磺酸盐分析是SEC-MALS和FFF-MALS的最苛刻应用之一。在DAWN和Eclipse的先进技术特性的帮助下,通过FFF-MALS成功地表征了它们的绝对摩尔质量分布。

WP2303:使用SEC-MALS和FFF-MALS表征木质素和木质素磺酸盐综述了MALS在木质素和木质素磺酸盐中的应用。在网络研讨会上探讨了木质纤维素材料的应用木质纤维素材料的绝对大分子和纳米颗粒表征

fff-mals

木质素对MALS激光的吸收由前向监测器定量。


工业木质磺酸盐分析

木质素磺酸盐使用制浆工艺中一种常见的廉价副产品,可再生材料具有广阔的前景。通过GPC分析工业木质磺酸盐需要大量且费力的样品前处理。

FFF-MALS可固有地从木质素磺酸盐中除去杂质,从而实现了一步纯化和表征的过程,如AN2301:AF4-MALS对木质素磺酸盐的分析所述。

 


分析有机溶剂中的聚合物

在油漆,橡胶和粘合剂工业中使用的技术上重要的聚合物的许多性能取决于摩尔质量分布和分子结构的细节。尤其是聚合物链支化是许多这些特性的关键决定因素。

WP2304:使用FFF-MALS分析有机溶剂中的聚合物,对使用FFF-MALS在有机载体溶剂中分析合成聚合物进行了综述。




 更多生物聚合物应用

 更多合成聚合物应用

 聚合物表征网络视频

fff-mals

FFF-MALS一次即可表征溶解的分子和悬浮的纳米凝胶。


工程和环境纳米粒子

单颗粒ICP-MS

工程化的纳米颗粒(ENP)已被广泛使用,因此就对人类和环境的可能毒性影响而言,已成为科学关注的主题。一个关键的挑战是检测和识别复杂流体基质中的金属ENP。电感耦合等离子体质谱仪非常灵敏,甚至可以配置为识别和确定单个颗粒的大小。

ICP-MS和sp-ICP-MS与Eclipse FFF系统耦合以监测由离子强度变化引起的粒径分布变化和回收率,AN2604:用AF4-ICP-MS表征金纳米颗粒

fff-mals


环境示踪剂

FFF-MALS-DLS与ICP-MS的结合在环境分析中很重要,以评估溶液中存在的颗粒的组成,大小和数量。这项技术可以在万亿分之一的水平上识别颗粒的大小和元素组成。

网络研讨会:质量,大小,组成:生物分子和纳米颗粒的场流分馏以及通过光散射和ICP-MS表征的FFF-ICP-MS实例可用于鉴定源自废水和垃圾填埋场的土壤样品中的示踪纳米颗粒。

 


银-脂质复合物

银,特别是微银,由于微动力学作用而显示出抗微生物活性。银和纳米结构脂质载体(NLC)的结合导致形成银纳米脂复合物。这种复合物被开发为敏感性皮肤的化妆品,还具有抗特应性皮炎的活性。然而,在配制工作中,标准方法(例如DLS和Zeta电位)无法确定微银在NLC表面的吸附。

FFF-MALS被证明对银-纳米脂质复合物的形成高度敏感,如银纳米脂质所示。




 更多纳米颗粒应用

 纳米颗粒表征网络视频

fff-mals


Eclipse-VISION-ASTRA:一套完整的工作流程

通过内置的智能和复杂的软件,Eclipse系统创新并简化了FFF-MALS实验的完整工作流程。该系统使技术人员、临时用户以及专家科学家能够使用FFF-MALS的全部功能和多功能性。

fff-mals


如何使用FFF-MALS?

Eclipse FFF系统是为一个流线型的、完全自动化的工作流而设计的,使得开发、优化和运行分离方法变得简单。一旦建立了一种方法,只需将样品移液到自动进样器小瓶中并单击“运行”即可。Eclipse,DAWN和VISION会告诉您一切是否进展顺利或需要您注意。

fff-mals

计算机辅助方法开发

让您的PC完成工作

FFF的多功能性和灵活性(分离,范围和灵敏度取决于流速比)意味着通常针对新样品开发优化的流速程序。 VISION DESIGN模块可进行基于物理的FFF仿真,以进行计算机方法设计和优化,因此无需运行测试方法矩阵。

只需列出估计的粒径,选择FFF通道,膜和垫片,并指定错流梯度即可。 VISION DESIGN使用基本FFF理论立即显示预测的分数图,以计算保留时间。

只需几分钟,您就可以在舒适的办公桌上探索不同的交错流速率和定时效果,以提高分辨率并找到最佳方法。

完善方法

单击即可将最终设计转移到VISION RUN,以测试您的方法。您最初对样本和通道参数的猜测可能是不准确的,但无需担心-物理实验的结果可以反馈到VISION DESIGN中,以进一步完善该方法。通常,一次测试就可以为VISION DESIGN提供所需的信息,以帮助您完全优化方法。

fff-mals

VISION DESIGN中的方法


样品和系统准备

光散射对微粒特别敏感,微粒通常是MALS信号中的主要噪声源,但几乎没有UV和dRI信号。从样品和溶剂中清除颗粒并不困难,但确实需要一些努力。

样品应按照预期的尺寸范围以0.22、0.45或1 µm的孔径进行过滤。流动相应过滤至0.1 µm,尽管使用更常见的0.22 µm过滤器可获得可接受的结果。另外,在泵和注入回路之间的系统中添加了一个0.1 µm的过滤器。

我的系统干净吗?

用新溶剂冲洗系统后,如果系统没有足够的颗粒以进行高质量的MALS测量,则可能不太明显。 DAWN前面板上的系统状态监视器可让您知道噪声水平是否低于可接受数据的建议最大值。

流体是否工作正常?

稳定,无波纹的流动对于FFF分离的最佳分辨率和可重复性至关重要。 VISION RUN使您知道它们是否在可接受的范围内。 Eclipse前面板显示流速和压力,并且会告知您任何压力是否超过极限。

所有系统都正常吗?

只需看一下Eclipse的显示,方法状态就很明显。 Eclipse和DAWN中的连续自我诊断功能可确保您在出现任何导致次优运行的条件时立即知道。您还将收到有关如何使系统恢复最佳性能的可行建议。维护监视器将在进行预防性维护时通知您。

fff-mals

DAWN上的系统运行状况指示器


fff-mals

Eclipse上显示的系统状态


运行FFF-MALS实验

在将样品吸取到自动进样器样品瓶中并向泵中灌注一瓶载液后,使用VISION DESIGN开发的方法或已建立的方法在VISION RUN模块中设置序列。然后,单击鼠标即可运行整个样本集。

进入驾驶舱

VISION RUN是Eclipse FFF系统的复杂控制中心。仪表板通过直接访问仪器配置和样品序列实时显示系统状态。显示Eclipse仪器的“运行状况指示器”中的状态信息;如果出现任何警告,您将收到可行的建议。在运行序列时,可以添加新样品和其他进样。

扩大视野

VISION RUN控制1260系列的Agilent®模块。支持自动进样器,等度或四元泵,二极管阵列检测器,荧光检测器和馏分收集器的完整功能集,以从FFF实验中提取最大值。

展望未来,了解更多

VISION RUN同步并启动ASTRA软件,该软件负责从光散射,RI和UV检测器获取和分析数据。当ASTRA在后台运行以获取数据时,可以在VISION中查看信号。

另外,VISION RUN可以获取紫外线和流量数据以进行诊断和方法改进;如果安装了Mobility EAF4模块,它还将获取pH和电导率测量值。

fff-mals

fff-mals


数据分析

通常在ASTRA软件中对检测器数据进行分析以进行样品表征。在某些情况下,Eclipse和UV数据会重新导入VISION中以进行其他分析。

MALS,DLS等

在ASTRA中进行光散射,UV和RI数据的处理,以确定摩尔质量,大小,组成和构象,该布局类似于标准色谱软件。输入一些特定于样品的参数,例如紫外线消光系数和dn / dc,然后设置基线并选择峰,其余的由软件完成。多次运行的结果可以覆盖在EASI图中,并在EASI表中进行整理。

有关ASTRA中各种分析和报告功能的详细信息,请参见: https://www.wyatt.com/products/software/astra.html.

粒径,方法改进和Zeta电位

VISION中记录的流量,紫外线和电气数据可以在VISION中进行处理,以进行特定分析:

  • 从FFF保留体积获得的粒径估算值
  • 完善分离方法,因为确定的粒径可能与最初的样品含量有所不同
  • 通过测量两个或多个电场下每个峰的保留位移来计算zeta电位

fff-mals

ASTRA的EASI表可合并来自多个数据文件的结果。


系统维护

Eclipse / DAWN FFF-MALS系统的维护是最少的。 泵滤膜通常每两个月更换一次,FFF通道中的超滤膜每隔约100次运行。 可以使用20%乙醇或标准洗涤剂冲洗系统并对其进行消毒。 服务提醒和广泛的系统参数日志有助于维持系统的完美状态并防止停机。

fff-mals


组成FFF-MALS系统的模块

Eclipse / DAWN FFF-MALS系统仅包含最先进和可靠的组件子系统。 主要模块由Wyatt Technology在美国设计和制造,其他组件是安捷伦的顶级产品。 整个系统由Wyatt Technology提供,安装和维修。*

*在Wyatt Technology现场办事处无法提供的市场中,安捷伦产品可能由当地的安捷伦分销商提供和服务。

fff-mals


FFF组件

Eclipse

Eclipse FFF仪器是FFF系统的核心。它集成了四个高精度和稳定的流量控制器,可确保最稳健和可重复的分馏运行,而不会导致其他FFF系统中的多个泵相关的脉动和固有的不可靠性。

Eclipse提供了一个智能的用户界面,可以反映其复杂程度,并向用户通知需要注意的事件或条件。此外,该设计将针尖进样和聚焦区进样结合在一起,从而可以使用多种FFF分离通道,甚至使用体积排阻色谱柱。

可选功能:

  • FFF-SEC切换:此选项支持两个不同的分离通道,通常是一个FFF通道加上一个SEC色谱柱,它们共享相同的自动进样器,泵和检测器。只需单击鼠标,即可将分离模式从SEC更改为FFF。
  • 稀释控制模块(DCM):每个Eclipse FFF通道都包含一个DCM端口,当与Eclipse DCM模块结合使用时,该通道可将从该通道洗脱的样品稀释度降低多达5倍,而不会降低分辨率(总范围可达10倍)。此功能可提高灵敏度和收集馏分中的浓度。严格控制的检测器流速以及动态光散射测量的性能也极大地提高了可重复性。

对Eclipse的更多信息感兴趣?

查看Eclipse产品页面

fff-mals


Mobility

由Mobility Module和Mobility流道组成的Mobility系统与Eclipse结合使用以实现电/非对称流FFF(EAF4),以测量电荷和zeta电位。

查看手册

流道

每个Eclipse流道都包括一个DCM端口,以提高灵敏度和温度稳定性,以增强可重复性。 FFF通道的选择及其应用:

fff-mals


渠道类型 优点 应用
分析性短流道 快速的纳克/微克分离 通用型
分析性长流道 纳米/微克分离 聚合物,不易过载
半制备 毫克分离 细胞外囊泡,病毒和LNP分离
Dispersion inlet 对于易于聚集的样品 单克隆抗体,脂质体
Mobility EAF4 按大小和电荷分开 Zeta电位分布

泵,自动进样器和馏分收集器

Eclipse随附了行业标准的Agilent 1260系列四元泵和自动进样器。支持其他安捷伦组件,包括馏分收集器。

 


VISION

VISION软件是FFF的后脑。它提供智能的方法设计,操作和分析,并全面控制所有FFF组件。 VISION与ASTRA接口-ASTRA是领先的软件,可通过光散射表征溶液中的​​大分子和纳米颗粒。

有兴趣了解有关VISION精心设计的无缝FFF工作流程的更多信息吗?

查看VISION产品页面

fff-mals


检测器

DAWN®

随处可用的最敏感的MALS检测器。 结合18个角度的检测器来确定200 Da至1 GDa的摩尔质量和10 – 500 nm的半径。

标准选项:环境温度

加热/冷却选项:-15°C至+150°C

DAWN提供了处理荧光样品的特殊选项:荧光阻挡滤光片和785 nm红外激光。 此外,DAWN可以与动态光散射结合使用,以实现更全面的表征。

有兴趣了解更多有关DAWN的信息吗?

查看DAWN产品页面

在线DLS

WyattQELS™ - 动态光散射模块,可以嵌入在线DLS的DAWN MALS仪器中。

查看WyattQELS信息

DynaPro® NanoStar® - 独立的动态光散射检测器,可以通过光纤连接到在线DLS的DAWN流通池。

查看NanoStar产品页面

fff-mals


Optilab®

独特的在线示差折光仪,用于测量任何大分子的浓度,而不受有色基团影响。 温度控制在4°C至65°C之间。 高浓度选项可容纳高达180 mg / mL的蛋白质浓度。

有兴趣了解更多关于Optilab的信息吗?

查看Optilab产品页面

fff-mals


ASTRA®

全面的软件,可用于色谱,AF4或批处理模式下的MALS分析。 ASTRA提供符合21CFR(11)的版本,并提供其他选项,例如颗粒分析。 提供多种类型的构象分析,包括构象图,颗粒浓度和形状因子。

有兴趣了解更多有关ASTRA的信息吗?

查看ASTRA产品页面

fff-mals


了解有关FFF-MALS功能的更多信息

您可以在下面找到我们网站上可用资源的部分列表,在这里您可以了解有关FFF-MALS的更多信息,以及世界各地的科学家,学术界,工业界和政府实验室如何将其用于先进的大分子和纳米粒子表征。

理论

有关FFF-MALS理论的详细信息,请参见以下页面:

参考书目

可在www.wyatt.com/Bibliography上找到大量引用Wyatt FFF-MALS仪器的可检索书目。 只需打开“高级搜索”,然后单击“多角度光散射”框,然后在下面输入搜索词。

技术说明

Wyatt通过 Wyatt支持中心为客户提供全面的在线支持,其中包括许多技术说明,可以帮助您充分利用FFF-MALS实验。 如果您是客户并且没有访问权限,请在“支持登录”页面上请求一个帐户。

在 Wyatt,这是每个人的目标

您的成功是我们的! 从您购买Wyatt仪器开始,我们就一步步为您服务,不仅为您提供仪器保修。 怀亚特(Wyatt)提供了一整套支持服务,可帮助您充分利用投资。 最重要的是,您会获得无与伦比的个人关注,以确保成功和生产力。

fff-mals


现场安装和培训

每次购买仪器时,我们都会在您的实验室提供现场安装和熟悉的访问,以确保正确的仪器设置和功能。 我们还根据您的特定需求提供定制的现场培训。 如果一大批工作人员想接受指示,那么这些附加服务可能尤其理想。

fff-mals


第一年的服务和支持

所有新型Wyatt仪器都提供了全年无限制的电话和电子邮件支持,以及在第一年保修期间的标准全覆盖范围。 我们的博士研究生 科学家和专家技术人员提供技术和应用程序帮助。 我们将向您展示如何通过远程访问PC来分析数据或设置仪器通信。

在第一年之后,可以提供年度服务计划,以提供无限制的连续电话,电子邮件支持和仪器服务。 服务计划的好处包括年度预防性维护,现场校准,重新认证以及零件和人工折扣以进行维修。 了解有关服务计划的更多信息

第一年服务的细节以及持续支持可能会因地区而异。 请联系您当地的Wyatt代表以获取更多信息

fff-mals


IQ / OQ和合规性

Wyatt Technology提供了一个完整的合规性计划,包括其所有仪器的文档和现场验证。 我们提供必要的资源和工具以确保合规性。 我们已经与合作伙伴在合规环境中进行了广泛的合作,以建立一套强大的文档和服务。 Wyatt仪器和软件已在全球制药,生物技术和其他受管制行业的GMP环境中使用。 详细了解我们的合规计划

fff-mals


光散射大学

我们购买的每台仪器都包括我们的旗舰培训计划Light ScatteringUniversity®(LSU),它为新用户提供了正确的起点,并为他们提供了最佳的基础。在2天,3天或4天的课程中(取决于购买的系统),LSU学生会发现他们可能不熟悉的高级数据处理方法和替代分析工具。学生还将学习他们的MALS和DLS数据如何补充他们在实验室中使用的其他技术的信息。我们为LSU毕业生提供了更详细的技术和主题的高级课程。

在LSU期间,我们的学生会见了创始人和董事会主席Philip Wyatt博士,他进行了广受好评的光散射仪器博物馆之旅。学生还会遇到发明,制造,维修和支持仪器的人员,因此他们知道回到实验室后会为他们提供支持的团队。

对于购买我们的一种光散射仪器的北美客户,LSU积分包括机票,住宿和大部分餐点。当您在这里时,我们会努力工作,但您会饱餐一顿-在圣塔芭芭拉的多家餐厅!

在这里了解更多。.

fff-mals


服务计划

在Wyatt,我们了解到停机和生产力损失至关重要,因此制定了两项全面的服务计划-我们的金牌和银牌服务计划-这些服务计划是专门为使年度预防性维护和仪器维修要求快速,顺利且无忧而设计的。在第一年仪器保修期满后,这些计划每年都可用,并提供持续的无限制电话,电子邮件支持和仪器服务。

我们的黄金服务计划提供全面的现场预防性维护和维修服务。训练有素的Wyatt现场服务工程师将来到您的工厂,并进行年度预防性维护,校准和重新资格检查。我们专门的现场服务协调员可以管理仪器服务时间表,以便您专注于研究。如果仪器需要工厂维修,我们还提供借贷单位。

借助我们的白银服务计划,您可以期望进行全面的仪器校准和质量控制测试,并根据需要提供包括零件,人工,运输和硬件更新在内的优先服务,以及通过电话,电子邮件和金牌服务计划提供的屏幕共享会话。

在这里了解更多

fff-mals


基于网络的支持

我们的客户支持中心包含与Wyatt光散射仪器,软件和应用程序相关的所有方面的大量有用资源:

  • 软件更新和错误修复
  • 有关如何连接和使用仪器和软件的技术说明
  • 视频教程,软件教程和教育网络研讨会
  • 新用户指南中的新用户学习资源部分
  • 参考资料,例如用户手册,Wyatt标准的分析证书,CE和TUV声明

在此处注册或登录支持中心

fff-mals


咨询服务

通过特殊安排,我们可以由应用科学家提供扩展的现场咨询服务,以在您的实验室中的仪器上设置方法和运行样品。 这样就避免了将样品发送到现场进行分析的麻烦,并且可以与现有最佳专家进行密切的实时咨询。 可用性可能仅限于某些地理区域。

如果您想让我们的实验室人员为您分析样品并提供咨询,请探索Wyatt的 内部样品分析服务

fff-mals


Wyatt Technology 商店

通过我们的在线商店,全球客户可以搜索零件,消耗品和配件,并查看产品图片和零件编号。 该商店按Wyatt产品系列分类,可轻松了解哪些零件与您的仪器兼容。 美国和加拿大的客户可以注册帐户,并使用采购订单或信用卡订购零件和配件。

浏览我们最受欢迎的易损件,查看您的订单历史记录,并轻松地在线下订单。 如果您对哪种SEC色谱柱最适合您的应用有疑问,请查看我们用户友好的SEC色谱柱指南。 通过回答有关样品的几个问题,我们的SEC色谱柱选择工具将根据您的输入将您引向推荐的色谱柱。 除了订购零件和配件外,您还可以查询我们的培训课程,IQ / OQ验证和服务计划。

在此处访问我们的在线商店

fff-mals