Erweitern Sie Ihre Möglichkeiten zur Charakterisierung von Makromolekülen

Unsere Detektoren für Mehrwinkel-Lichtstreuung und Brechungsindex stellen die führende Technologie in ihren Kategorien dar. Kombiniert schaffen sie eine völlig neue Ebene der Leistungsfähigkeit, die Ihre Charakterisierungsmöglichkeiten deutlich erweitert.

DAWN®

Der empfindlichste MALS-Detektor, der auf dem Markt erhältlich ist. Er enthält auf 18 Winkel Detektoren zur Bestimmung von molaren Massen im Bereich von 200 Da bis 1 GDa und Radien im Bereich von 10 bis 500 nm.

Optilab®

Ein einzigartiges Online-Differenzialrefraktometer zur Konzentrationsmessung beliebiger Makromoleküle, unabhängig von Chromophoren. Das Hochkonzentrations-Optilab hat einen erweiterten Konzentrationsbereich für Proteinkonzentrationen bis zu 180 mg/mL.

Nicht schätzen

Während es viele Möglichkeiten gibt, die molare Masse bzw. das Molekulargewichte von Makromolekülen wie Proteinen, Biopolymeren und synthetischen Polymeren zu bestimmen, gibt es nur eine, die die absoluten Molekulargewichte in Lösung schnell und effektiv ermittelt: Die statische Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS). MALS kombiniert die präzise Messung der Lichtstreuintensität und der Konzentrationen für eine genaue Berechnung der Molekulargewichte in Lösung, ohne Annahmen der Konformation und ohne die Probe zu verändern.

Identifikation

Die molare Masse ist der Schlüssel zur Identifizierung von Proteinen, ihren Oligomeren oder Komplexen. Dennoch verlassen sich allzu viele Proteinforscher auf eine vereinfachte, ungültige Analyse des Molekulargewichts durch SDS-PAGE oder traditionelle Größenausschlusschromatographie (SEC). Diese Techniken berufen sich auf Annahmen zur Konformation und zu idealen Matrixinteraktionen, die mit zweideutigen oder völlig falschen Ergebnissen täuschen können, was zu einer grundlegend ungenauen Interpretation von Daten unter anderem für wissenschaftliche Publikationen führt.

Die Mehrwinkel-Lichtstreuung gekoppelt mit SEC (SEC-MALS) ermöglicht eine genaue Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen, Oligomeren und Komplexen, unabhängig von Konformation oder nicht-idealen Säulenwechselwirkungen. Das liegt daran, dass SEC-MALS eine Molmassenanalyse nach den ersten Prinzipien darstellt, die nicht auf Retentionszeit oder Kalibrierung mit Referenzmolekülen angewiesen ist. Die einzige Funktion der SEC-Säule ist die Trennung der Moleküle nach Größe, während MALS die molare Masse der eluierenden Proteine unabhängig von der Retentionszeit bestimmt.

Konjugate

Viele interessante und nützliche Makromoleküle bestehen aus zwei chemisch und physikalisch unterschiedlichen Spezies, die kovalent, koordinativ oder über Wasserstoffbrücken gebunden sind. Dies kann es recht schwierig machen, die wesentlichen Eigenschaften molarer Masse und Größe durch Größenausschlusschromatographie zu charakterisieren, da keine Kalibrierstandards existieren, die das Elutionsverhalten beider Komponenten repräsentieren. Oft ist einer oder beide der Hauptbestandteile nicht für die Massenspektrometrie zugänglich.

Die Kombination von Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS), UV- und Brechungsindex-Detektion mit Größenausschlusschromatographie, plus ASTRA®'s Algorithmus für die Konjugat-Analyse, bietet die Lösung für die Charakterisierung von konjugierten Makromolekülen wie:

  • Block-Copolymere
  • Glykoproteine, Lipoproteine und Nanodiscs
  • PEGylierte Proteine
  • In Detergenzmizellen solubilisierte Membranproteine
  • Protein-Polysaccharid-Impfstoffe
  • Antikörper-Wirkstoff-Konjugate

Konzeptionell kann ein Komplex, der aus einem Protein, das ein UV-Chromophor enthält und einem Modifikator wie Polyethylenglykol oder PEG, das kein UV-Chromophor enthält, besteht, durch die Kombination von Informationen aus zwei verschiedenen Messungen analysiert werden. Die UV-Absorption bestimmt die Proteinkonzentration, während der RI die Gesamtkonzentration der Makromoleküle bestimmt. Die PEG-Konzentration ist die Differenz zwischen diesen beiden Werten. Eine genaue Berechnung berücksichtigt die Extinktionskoeffizienten und unterschiedlichen Brechungsindizes beider Spezies. Diese beiden Messungen sind ausreichend, um das Verhältnis von Protein und Modifikator im Komplex zu bestimmen. Diese Analyse kann jedoch nicht die Gesamtmasse oder den oligomeren Zustand der Spezies bestimmen.

Die Hinzunahme eines MALS-Detektors bietet die Antwort auf die vollständige Charakterisierung der Konjugate. Da die Lichtstreuung proportional zum Produkt aus molarer Masse und Konzentration ist, reicht die Kombination dieser drei Signale aus, um nicht nur das Verhältnis, sondern die tatsächliche molare Masse und damit den oligomeren Zustand jedes Bestandteils zu bestimmen. Diese Information ist entscheidend für die Beurteilung der Aggregation von Konjugaten, die Messung der molaren Masse von Block-Copolymeren oder die Entscheidung, ob ein Detergens stabilisiertes-Membranprotein als natives Oligomer vorliegt oder nicht.

Membranproteine

Mit Detergenz solubilisierte Membranproteine sind aufgrund der das Protein umgebenden Tensidmizelle besonders schwierig mit traditionellen Techniken oder mit Massenspektroskopie zu analysieren. Denaturierende SDS-PAGE dissoziiert native Oligomere und schließt deren Identifizierung aus, während die vernetzte Massenspektroskopie Oligomere erzeugen kann, die in Lösung nicht existieren.

Ebenso können stark glykosylierte Proteine nicht durch Referenzstandards oder gängige Modelle für globuläre Proteine dargestellt werden und sind daher für die Analyse mit traditionellen Techniken nicht geeignet.

Diesen Herausforderungen begegnet die mit SEC gekoppelte Mehrwinkel-Lichtstreuung (SEC-MALS), die zwischen einem Protein und seinem assoziierten Detergenz oder Kohlenhydrat unterscheiden kann, indem sie Daten von drei Detektoren nach der SEC-Trennung kombiniert: UV, MALS und differentieller Brechungsindex (dRI). Der Algorithmus in ASTRA für die Konjugatanalyse berechnet die molare Massen sowohl der proteinhaltigen Komponente als auch der konjugierten oder mizellaren Komponente. Der wahre oligomere oder komplexierte Zustand des Proteins sowie der Grad der Glykosylierung werden eindeutig bestimmt.