Größenausschlusschromatographie – Einführung in die Stofftrennung nach Molekülgröße

Wie funktioniert die Größenausschlusschromatographie?

Der Trennungseffekt bei der Größenausschlusschromatographie beruht auf den unterschiedlichen Diffusionsvolumina von Molekülen verschiedener Größe. Kleinere Moleküle sind in der Lage, die porösen Polymere der stationären Phase zu durchdringen. Dadurch vergrößert sich das ihnen zur Verfügung stehende Diffusionsvolumen, wodurch sich ihre Retentionszeit verlängert. Demnach werden sie stärker zurückgehalten als große Moleküle, die sich nur durch die Zwischenräume zwischen dem Polymergranulat fortbewegen können und deshalb schneller durch die Chromatographiesäule gelangen. In den früheren Fraktionen des Eluats sind daher große Moleküle zu finden, während die kleineren später eluieren.

Jeweils sehr kleine oder sehr große Moleküle lassen sich mit der Größenausschlusschromatographie nicht separieren. Alle Moleküle, die nicht in die Poren der stationären Phase diffundieren können, eluieren gleich zu Beginn, während kleine Moleküle (z. B. Salze), bis zum Schluss verbleiben. Daher eignet sich die Größenausschlusschromatographie vor allem zur schnellen Isolierung größerer Moleküle.

Bei der Größenausschlusschromatographie polarer Biomoleküle wie Proteine und Antikörper kommen oft rein wässriger Puffer (z.B. PBS, HEPES, TRIS) als mobile Phase zum Einsatz. Als geeignete stationäre Phase hat sich Silicagel erwiesen. Bei polaren bis mittelpolaren Polymeren finden wässrige oder polar organische Eluenten oder Mischungen aus beiden Verwendung. Dabei dient oft Polymethylacrylat oder Polyvinylalkohol als stationäre Phase. Für die Größenausschlusschromatographie unpolarer Polymere hat sich die Kombination aus rein organischen Eluenten und Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren (PS/DVB) bewährt.

Über die Porengröße der stationären Phase der Größenausschlusschromatographie entscheidet das Molekulargewicht der Probensubstanz bzw. deren Größe im Lösungsmittel. Damit lässt sich ein Molekulargewichtsbereich von circa 0,1 bis 20.000 kDa abdecken. Zur Trennung von Molekülen mit Molmassen von fünf bis 150 kDa werden beispielsweise mittlere Porengrößen um 12,5 nm eingesetzt. Bei Molekülgrößen von 10 bis 500 kDa finden Porengrößen um 25 nm Verwendung, bei Partikeln von 20 bis 10.000 kDa Porengrößen von 45 nm.

Grundsätzlich nutzt die Größenausschlusschromatographie zwei Typen von Säulen:

• Single-Porosity-Säulen und
• Linear-Säulen (auch: Mixed-Bed-Säulen).

Erstere haben Poren mit sehr geringer Porengrößenverteilung und eignen sich sehr gut zum Trennen in einem bestimmten Größenbereich. Ist eine Separation über einen größeren Molmassenbereich gewünscht, werden häufig mehrere Trennsäulen mit unterschiedlichen Porengrößen hintereinander geschaltet.

Bei Linear-Säulen ist die stationäre Phase so abgemischt, dass alle Porengrößen von sehr klein bis groß vorhanden sind. Diese Säulen trennen Analyten über einen großen Molmassenbereich hinweg. Da ihre Trennleistung begrenzt ist, werden auch hier mehrere Trennsäulen kombiniert, um eine bestmögliche Auftrennung zu erzielen.

Für die Größenausschlusschromatographie eignen sich prinzipiell die gleichen Detektoren wie für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Darüber hinaus kommen in der Polymeranalytik auch Viskositäts- und Lichtstreudetektoren zur Anwendung, um spezifische Struktur- und Molekülinformationen der Probensubstanz zu erhalten.