HPLC – Hochleistungsflüssigkeitschromatographie für schnelle und effiziente Trennergebnisse

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist eine leistungsstarke Methode zur Identifikation, Quantifizierung und Reinigung von Stoffgemischen. Sie eignet sich sowohl für analytische als auch für präparative Trennungen und liefert tiefgreifende Einblicke in die Zusammensetzung und die Struktur chemischer und biochemischer Verbindungen. Ihre Stärken kann sie vor allem in der Biochemie ausspielen, insbesondere bei der Präparation und der Analyse von Proteinen, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Enzymen und Peptiden und anderen Substanzen mit hohen Molekulargewichten.

Inhaltsverzeichnis:

  • Was ist Hochleistungsflüssigkeitschromatographie?
  • Wie funktioniert die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie?
  • Mit welchen Detektoren arbeitet die HPLC?
  • Wofür wird die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie genutzt?
  • Waters | Wyatt - Ihr leistungsstarker Anbieter für zuverlässige HPLC-Lösungen

Was ist Hochleistungsflüssigkeitschromatographie?

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist ein Trennverfahren, mit dem Substanzen nicht nur getrennt, sondern auch über Standards oder absolute Methoden identifiziert und quantifiziert werden können. Die Abkürzung HPLC bezieht sich auf die englische Bezeichnung "high performance liquid chromatography". Im Gegensatz zur Gaschromatographie lassen sich mit dem HPLC-Prinzip neben verdampfbaren Stoffen auch nicht-flüchtige Substanzen trennen.

Zu den Wegbereitern der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zählen die US-amerikanischen Chemiker Joseph Jack Kirkland (1925 - 2016) und John Calvin Giddings (1930 bis 1996), der österreichische Chemiker Josef Franz Karl Huber (1925 - 2000) sowie der ungarisch-US-amerikanische Chemieingenieur Csaba Horváth (1930 - 2004).

Wie funktioniert die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie?

Bei der HPLC handelt es sich im Grunde um eine technisch optimierte Säulenchromatographie. Während Letztere mit Schwerkraft arbeitet, wird die mobile Phase bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie über eine Pumpe mit hohem Druck in das System eingebracht. Dadurch läuft der Trennvorgang deutlich schneller und effizienter ab als bei der herkömmlichen Säulenchromatographie.

Im Wesentlichen besteht eine HPLC-Anlage aus folgenden Komponenten:

  • Pumpe
  • Injektor
  • HPLC-Säule mit stationärer Phase
  • Detektoren
Die Pumpe saugt die mobile Phase aus einem Vorratsgefäß an und führt sie mit hohem Druck in Richtung Säule. Über den direkt hinter der Pumpe befindlichen Injektor wird die Probe in das Laufmittel eingebracht. Das kann manuell geschehen, wird aber heutzutage meist automatisch über einen Autoinjektor (Autosampler) realisiert.

Zusammen mit dem Laufmittel gelangt der Analyt in die HPLC-Säule, in der sich die stationäre Phase befindet. Hierbei handelt es sich um sehr feinkörnige poröse Pulver, die unter mechanischem Druck dicht gepackt eingefüllt werden. Welches Säulenmaterial jeweils eingesetzt wird, hängt von den Eigenschaften der zu untersuchenden Stoffe ab. Die häufigste Variante ist die sogenannte C18-Säule, die chemisch modifiziertes Kieselgel mit C18-Ketten auf der Oberfläche enthält.

Wechselwirkt eine Komponente der zu analysierenden Substanz stark mit der stationären Phase, bleibt sie relativ lang in der Säule. Ist die Wechselwirkung nur gering, gelangt der jeweilige Probenbestandteil deutlich früher an den Ausgang.

Nach dem Trennprinzip wird die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wie folgt kategorisiert:

  • Umkehrphasen-HPLC (engl. reverse phase, RP)
  • Normalphasen-HPLC (engl: normal phase, NP)
  • Größenausschluss-HPLC (engl. size exclusion chromatography, SEC)
  • Ionenaustausch-HPLC (engl. ionen exchange, IEC)
  • Enantiomerentrennung (chiral chromatography)

Umkehrphasen-HPLC

Die in der Praxis gängigste Methode ist die RP-HPLC. Bei rund 70 Prozent aller analytischen Trennungen via Hochleistungsflüssigkeitschromatographie handelt es sich um Umkehrphasen-Trennungen. Hierbei kommt eine unpolare stationäre Phase zum Einsatz. Diese wird erzeugt, indem mit langkettigen Kohlenwasserstoffen substituierte Silane und Silicagel miteinander zur Reaktion gebracht werden. Bei diesem Vorgang wird die polare Oberfläche der Silicagel-Teilchen mit einer unpolaren Alkanschicht überzogen, wodurch sich ihre Polarität verringert.

Als mobile Phase dienen meist Mischungen aus Wasser oder einem Puffer und Methanol oder Acetonitril. Bei isokratischen Trennungen wird die Zusammensetzung des Laufmittels konstant gehalten. Bei Gradiententrennungen ändert das Fließmittelgemisch während der Analyse seine Polarität.

Normalphasen-HPLC

Die NP-HPLC nutzt eine polare stationäre Phase aus Silicagel/Kieselgel. Die Stärke der Elutionskraft des Laufmittels hängt in aller Regel von der Polarität ab. Je polarer die mobile Phase ist, umso schneller kann sie eine Substanz mitführen. Polare Moleküle werden durch die stationäre Phase länger zurückgehalten als unpolare, wodurch sie die Trennsäule erst später verlassen.

Der Nachteil diese Variante der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie besteht darin, dass sie sich meist nur für organische Lösungsmittel und nicht für wässrige mobile Phasen eignet. Abhilfe schafft die hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC), in der polare Phasen Verwendung finden, die mit wässrigen Puffersystemen als Laufmittel funktionieren. Das stärkste Elutionsmittel in der HILIC ist Wasser.

Größenausschluss-HPLC

Die SEC-HPLC trennt die Substanzen mit Druck nach ihrer Molekülgröße. Als Material für die HPLC-Säulen dienen poröse Gele mit definiertem Porendurchmesser. Moleküle, deren Größe die der größten Poren übersteigt, befördert die mobile Phase ohne Verzögerung zum Säulenausgang. Kleine Moleküle diffundieren in die Poren. Dadurch verlängert sich ihre Wegstrecke und sie brauchen länger, um die Säule zu durchwandern.

Ionenaustausch-HPLC

Bei dieser Form der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie erfolgt die Trennung aufgrund unterschiedlicher Ionenladungen und Ionengrößen. Die stationäre Phase ist ein Ionenaustauscher.

Enantiomerentrennung mittels HPLC

Um ein Enantiomerenpaar per Chromatographie trennen zu können, ist ein asymmetrischer HPLC-Aufbau erforderlich. Die nötige chirale Funktionalität lässt sich auf unterschiedliche Weise erzielen:

  • Die mobile Phase ist achiral, die feste stationäre Phase chiral.
  • Die mobile Phase ist achiral, die flüssige stationäre Phase (Film auf einem Trägermaterial) chiral.
  • Die mobile Phase liegt als chirales Reagenz im Lösungsmittel vor, während die stationäre Phase achiral ist.

Mit welchen Detektoren arbeitet die HPLC?

Der in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit Abstand am häufigsten eingesetzte Detektor ist der UV/VIS-Detektor. Bei diesem wird UV-Licht einer bestimmten Wellenlänge in eine Durchflussküvette eingestrahlt, dahinter mittels Photodiode aufgefangen und anschließend als elektrisches Signal ausgegeben.

Ein Spiegel lenkt den Lichtstrahl durch die Messküvette und eine Vergleichsküvette. Da die mobile Phase und die Probe das Licht unterschiedlich stark absorbieren, ergibt sich ein veränderndes elektrisches Signal. Die Differenz wird auf dem HPLC-Chromatogramm als Peak dargestellt. Die Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes wird abhängig vom UV-Absorptionsverhalten der Probe ausgewählt.

HPLC-Detektoren gibt es in zahlreichen Ausführungen, beispielsweise als:

  • Festwellendetektor,
  • variabler Detektor,
  • Photodiodenarraydetektor (PDA oder DAD),
  • Brechungsindexdetektor (RI),
  • Fluoreszenzdetektor (FLR),
  • Elektrochemischer Detektor (ECD),
  • Massensensitiver Detektor (LC-MS-Kopplung)

Neben UV-Detektoren können in Verbindung mit der HPLC-Chromatographie weitere Detektoren zum Einsatz kommen, zum Beispiel:

  • Polarimeter,
  • Leitfähigkeitsdetektoren,
  • Stickstoffdetektoren,
  • Radioaktivitätsdetektoren,
  • Viskositätsdetektoren und
  • Lichtstreudetektoren

Wofür wird die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie genutzt?

Die HPLC-Methode eignet sich sowohl für die analytische als auch für die präparative Anwendung. Zu den typischen Einsatzfeldern für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zählen:

  • die Analyse synthetischer Polymere,
  • die Analyse von Arzneistoffen,
  • die Analyse von Schadstoffen,
  • das Bestimmen von Wirkstoffen in biologischen Matrizes,
  • das Isolieren wertvoller Substanzen,
  • das Trennen und Reinigen von Biopolymeren und
  • die Reinheits- und Produktkontrolle von Feinchemikalien und Industrieprodukten.
Die analytische Identifizierung eines Probengemischs erfolgt für gewöhnlich durch den Vergleich der Retentionszeit der Probensubstanz mit der eines Vergleichsstoffes. Werden beispielsweise Probe und Vergleich gemischt und zusammen in das HPLC-Gerät eingespritzt, sollte der Peak im Falle einer Identität größer ausfallen. Zeigt sich in der HPLC-Auswertung ein zweiter Peak, stimmen Probe und Vergleichsstoff nicht überein.

Dass es sich im ersten Fall nicht um eine zufällige Überlagerung handelt, lässt sich durch das Wiederholen der Analyse mit einer anderen mobilen Phase sicherstellen. Noch sicherer ist ein Wechsel der stationären Phase (z. B. durch Nutzung der RP- statt der NP-HPLC). Hundertprozentige Sicherheit bietet allerdings nur eine qualitative Analyse des zum jeweiligen Signal gehörenden Stoffs.

Wie die klassische Säulenchromatographie lässt sich auch die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zum Reinigen von Substanzen wie biologischen Proben oder pharmazeutischen Produkten nutzen. Da hierbei um ein Vielfaches größere Mengen verarbeitet werden als bei analytischen Trennungen, sind meist Säulen mit deutlich größeren Innendurchmessern erforderlich.

Waters | Wyatt - Ihr leistungsstarker Anbieter für zuverlässige HPLC-Lösungen

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Weitere Fragen und Antworten zu HPLC

Aus welchen Komponenten besteht eine HPLC-Anlage?

Eine HPLC-Anlage besteht aus folgenden Komponenten:

  • Pumpe
  • Injektor
  • HPLC-Säule mit stationärer Phase
  • Detektoren

Wie wird HPLC kategorisiert?

  • Umkehrphasen-HPLC (engl. reverse phase, RP)
  • Normalphasen-HPLC (engl: normal phase, NP)
  • Größenausschluss-HPLC (engl. size exclusion chromatography, SEC)
  • Ionenaustausch-HPLC (engl. ionen exchange, IEC)
  • Enantiomerentrennung (chiral chromatography)

Mit welchen Detektoren arbeitet die HPLC?

  • Festwellendetektor,
  • variabler Wellenlängendetektor (VWD),
  • Photodiodenarraydetektor (PDA oder DAD),
  • Brechungsindexdetektor (RI),
  • Fluoreszenzdetektor (FLR),
  • Elektrochemischer Detektor (ECD),
  • Massensensitiver Detektor (LC-MS-Kopplung)

Wann wird HPLC angewendet?

HPLC wird angewendet für:

  • die Analyse synthetischer Polymere,
  • die Analyse von Arzneistoffen,
  • die Analyse von Schadstoffen,
  • das Bestimmen von Wirkstoffen in biologischen Matrizes,
  • das Isolieren wertvoller Substanzen,
  • das Trennen und Reinigen von Biopolymeren und
  • die Reinheits- und Produktkontrolle von Feinchemikalien und Industrieprodukten.