Refraktometer
Auch wenn der Begriff „Refraktometer“ außerhalb der analytischen Chemie nicht unbedingt sehr bekannt ist, ist doch das dahintersteckende Phänomen im Alltag in vielen Situationen zu beobachten. Ein Strohhalm in einem mit Limonade oder Wasser gefüllten Trinkglas erscheint von der Seite betrachtet nicht gerade zu sein, sondern wirkt an der Grenze zur Flüssigkeit geknickt. Dieses alltägliche Phänomen sorgt wohl kaum für Verwunderung, doch welche physikalische Erklärung steckt dahinter?
Tatsächlich sind die unterschiedlichen Brechungsindices von Wasser und Luft dafür verantwortlich, dass der Strohhalm abgeknickt erscheint. Dabei ist der Brechungsindex, auch als optische Dichte bezeichnet, das Verhältnis der Wellenlänge des Lichts im Vakuum zur Wellenlänge des Lichts in einem bestimmten Material. Der Brechungsindex ist abhängig von der Wellenlänge des einstrahlenden Lichtes und für viele Materialien (so zum Beispiel Wasser oder Luft) sehr genau bekannt.
Soll der Brechungsindex einer unbekannten Substanz bestimmt werden, so kann dies mit einem Refraktometer durchgeführt werden. Was wird noch mit dem Refraktometer gemessen? Kennt man den Brechungsindex einer Substanz, so kann ein Refraktometer auch zur Konzentrationsbestimmung eingesetzt werden. Dies ist eine der häufigsten und wichtigsten Anwendungen von Refraktometern – von der Bestimmung des Wassergehalts in Honig bis hin zur Analyse therapeutischer Proteine in der Pharmaindustrie. Der folgende Artikel führt zunächst in die Grundlagen der Refraktometrie mit Anwendungsbeispielen ein. Abschließend wollen wir zeigen, wie ein Refraktometer bei der Bestimmung der absoluten molaren Masse von Molekülen in einem Setup aus Größenausschlusschromatographie mit Mehrwinkellichtstreuung genutzt werden kann.
Tatsächlich sind die unterschiedlichen Brechungsindices von Wasser und Luft dafür verantwortlich, dass der Strohhalm abgeknickt erscheint. Dabei ist der Brechungsindex, auch als optische Dichte bezeichnet, das Verhältnis der Wellenlänge des Lichts im Vakuum zur Wellenlänge des Lichts in einem bestimmten Material. Der Brechungsindex ist abhängig von der Wellenlänge des einstrahlenden Lichtes und für viele Materialien (so zum Beispiel Wasser oder Luft) sehr genau bekannt.
Soll der Brechungsindex einer unbekannten Substanz bestimmt werden, so kann dies mit einem Refraktometer durchgeführt werden. Was wird noch mit dem Refraktometer gemessen? Kennt man den Brechungsindex einer Substanz, so kann ein Refraktometer auch zur Konzentrationsbestimmung eingesetzt werden. Dies ist eine der häufigsten und wichtigsten Anwendungen von Refraktometern – von der Bestimmung des Wassergehalts in Honig bis hin zur Analyse therapeutischer Proteine in der Pharmaindustrie. Der folgende Artikel führt zunächst in die Grundlagen der Refraktometrie mit Anwendungsbeispielen ein. Abschließend wollen wir zeigen, wie ein Refraktometer bei der Bestimmung der absoluten molaren Masse von Molekülen in einem Setup aus Größenausschlusschromatographie mit Mehrwinkellichtstreuung genutzt werden kann.
Was ist ein Refraktometer?
Bei einem Refraktometer handelt es sich um ein Messinstrument, mit dem der Brechungsindex von transparenten Flüssigkeiten oder Feststoffen bestimmt werden kann. Genutzt wird dabei das Verhalten des Lichts beim Übergang zwischen einem Prisma mit bekannten Eigenschaften und dem zu prüfenden Stoff. Die Idee ist keine besonders neue: Schon 1869 baute Ernst Abbé sein erstes Refraktometer für Carl Zeiss in Jena, was ab 1881 beworben wurde. Auch heute werden Refraktometer vielfach eingesetzt. Seit dem 19. Jahrhundert gab es natürlich große technologische Sprünge: Bei modernen Geräten handelt es sich häufig um digitale Refraktometer, die mit LEDs als Lichtquellen, hochwertig gefertigten Prismen und CCD-Sensoren arbeiten. An den physikalischen Grundprinzipien ändert sich natürlich nichts.Wozu dient die Messung mit dem Refraktometer?
Refraktometer bestimmen wie oben erwähnt den Brechungsindex flüssiger oder fester Substanzen, aus dem sich dann die Identität und Qualität sowie die Konzentration ableiten lassen. Gibt man z.B. zu destilliertem Wasser Traubenzucker (Glucose) hinzu, verändert sich der Brechungsindex in Abhängigkeit von der Konzentration. Gibt man Kochsalz (NaCl) in Wasser, verändert sich der Brechungsindex ebenfalls, aber nicht im gleichen Verhältnis zur Konzentration wie bei der Glucose. Durch exakte Messung des Brechungsindex ist so ein tieferes Verständnis über die Probe möglich. Konkret kann das bedeuten: Wenn Wasser bei 20 °C nicht den Brechungsindex von 1,333 nD aufweist, ist noch eine andere Substanz im Wasser gelöst. So lässt sich durch eine einfache Messung eine Aussage über eine Probe treffen, die sonst nur durch aufwändigere Analysen bestätigt werden könnte.In welchen Bereichen wird ein Refraktometer angewendet?
Die Einsatzbereiche von Refraktometern sind äußerst vielfältig, je nachdem, wie das Refraktometer als Messgerät eingesetzt wird. Einfache Handrefraktometer werden genutzt, um den Wassergehalt von Honig oder den Zuckergehalt von Trauben zur Weinherstellung zu bestimmen. Auch kann der Alkoholgehalt in Spirituosen festgestellt werden. So lässt sich die Qualität von Lebensmitteln bewerten und Herstellungsprozesse können überwacht und gesteuert werden.Im industriellen Umfeld werden Refraktometer auch für die Analyse von Betriebsflüssigkeiten in Automobilen verwendet. Ein Praxisbeispiel: Eine Refraktometer-Messung der Bremsflüssigkeit trägt zur Sicherheit im Straßenverkehr bei. Das zugrundeliegende Problem ist, dass Glykol-basierte Bremsflüssigkeiten hygroskopisch sind und sich durch mikroskopische Risse der Gummischläuche der Feuchtigkeitsanteil erhöht. Um die daraus resultierenden Veränderungen der Bremsflüssigkeitseigenschaften zu beherrschen, kann der Wassergehalt mit Hilfe eines Refraktometers genau bestimmt und so rechtzeitig ein Austausch der Bremsflüssigkeit veranlasst werden.
Auch in einem völlig anderen Kontext können Refraktometer eine Lösung darstellen: Differentielle Refraktometer (Brechungsindexdetektoren) wie das Optilab® von Wyatt können einer Größenausschlusschromatographie-Trennung (SEC) nachgeschaltet werden. Dies ermöglicht die Messung der Probenkonzentration einzelner Bestandteile wie z.B. natürliche oder synthetische Polymere, Proteine, virale Vektoren und LNP. Im Vergleich zu einem UV-Vis-Detektor oder einem Fluoreszenzdetektor besteht der Vorteil, dass die Probe kein spezielles Chromophor/Fluorophor beinhalten muss; es handelt sich somit um einen universellen Konzentrationsdetektor. Beispielsweise beinhalten viele natürliche und synthetische Polymere im Gegensatz zu Proteinen keine (UV-)Licht absorbierenden Gruppen – mithilfe eines Brechungsindexdetektors kann jedoch trotzdem die Konzentration bestimmt werden.
Ein weiterer Punkt ist, dass es ab einer bestimmten Größe (etwa 20 nm im Radius) zu Lichtstreuung auch im UV-Detektor kommt, was zu einer Überschätzung der Probenkonzentration führt. Ein Brechungsindexdetektor jedoch ist hierfür nicht empfindlich und bestimmt die korrekte Konzentration. In Kombination mit einem Mehrwinkel-Lichtstreudetektor kann dann das absolute Molekulargewicht ermittelt werden. Hierbei handelt es sich um aufwändige Präzisionsmessgeräte, die helfen, hochkomplexe Proben zu charakterisieren.
Wie funktioniert ein Refraktometer und welche verschiedenen Refraktometer gibt es?
Einfache Handrefraktometer und Abbe-Refraktometer beruhen auf einer Durchlichtmessung. Als Lichtquelle dient hier häufig das Sonnenlicht oder eine simple Glühlampe. Ein Lichtstrahl durchläuft zwei rechtwinklige Prismen, ein Beleuchtungsprima und ein Messprisma, die beide aus Glas mit demselben Brechungsindex bestehen.Wenn Licht auf die Grenzfläche von zwei Medien mit unterschiedlichen Brechungsindices trifft, so führt dies in der Regel zu Brechung und Reflexion des Lichts. Überschreitet der Einfallswinkel einen gewissen materialabhängigen Schwellenwert, wird das Licht nicht mehr gebrochen, sondern ausschließlich reflektiert. In diesem Fall spricht man von Totalreflexion.
Bei einem klassischen Refraktometer befindet sich in der Mitte beider Prismen ein Spalt, in dem sich die durchsichtige (und meist flüssige) Probe befeindet. Einfallendes Licht durchläuft die aufgeraute Beleuchtungsprisma-Innenseite und trifft durch die Aufrauung in verschiedenen Winkeln auf die Probe. Die Lichtstrahlen werden dann an der Grenzfläche zum Messprisma erneut gebrochen.
Was bedeutet dies für die Refraktometer Funktionsweise? Das Messprisma wird nur von Strahlen durchdrungen, die in einem kleineren Winkel als der kritische Winkel der Totalreflexion einstrahlen. Hierdurch wird auf einem Schirm ein Hell-Dunkel-Bereich abgebildet. Dann kann der Brechungsindex auf einer eingestellten Skala abgelesen werden.
Das Optilab® differentielle Refraktometer für SEC-MALS und CG-MALS
Wie wir bereits besprochen haben, beruht das Prinzip aller Refraktometer auf der Ablenkung von Licht an Grenzflächen von Prismen. Differential-Refraktometer gleichen den Brechungsindex einer Referenzprobe mit der zu testenden Probe ab, indem die Proben-Grenzfläche selbst ein Prisma bildet. In differentiellen Refraktometern wie dem Optilab® wird Licht also durch eine prismatische Proben- und Referenzzelle geleitet, wie in der Abbildung dargestellt ist.Nahezu jedes differenzielle Refraktometer verwendet zwei einfache Detektoren, um die Ablenkung des Lichtes zu messen. Diese Anordnung führt zu einem Kompromiss zwischen Empfindlichkeit und abgedeckter Konzentrationsspanne. Der 512-Detektoren-Array im Optilab bedeutet, dass eine maximale Empfindlichkeit über einen viel größeren Konzentrationsbereich abgedeckt werden kann. So kann in der Chromatographie ein winziger Peak im Nanogramm-Bereich quantifiziert werden, der von einem Peak im Milligramm-Bereich überlagert wird.
In einem CG-MALS-Setup kann dies nun genutzt werden, um in Kombination mit einem MALS-Lichtstreudetektor die Bildung von Homo- und Heterokomplexen zu analysieren. Beispielhaft sei hier die Bestimmung des zweiten Virialkoeffizienten (A2) von therapeutischen Proteinen und Peptiden erwähnt. Integriert man in so ein System oder ein SEC-MALS-System auch eine Avalanche-Photodiode, so kann mittels Dynamischer Lichtstreuung außerdem der hydrodynamische Radius der Probe bestimmt werden.
Welche Einheiten sind beim Gebrauch des Refraktometers wichtig?
Zum einen kann mit einem Refraktometer der absolute Brechungsindex (auch aRI) bestimmt werden. Da der Brechungsindex einer Substanz durch den Quotienten der Wellenlängen des Lichtes im Vakuum zu der Wellenlänge im Material definiert wird, ist der Brechungsindex selbst dimensionslos.Des Weiteren ermöglicht ein Differential-Refraktometer auch die Messung des Brechungsindex-Inkrements, auch als dn/dc bezeichnet. Er stellt die Änderung des Brechungsindex (dn) einer Lösung in Bezug auf die Änderung einer gelösten Probenkonzentration (dc) dar. Hierfür injiziert man verschiedene bekannte Konzentrationen eines Stoffs in das Gerät. Das Brechungsindex-Inkrement wird gewöhnlicherweise in der Einheit mL/g angegeben.
Die Kenntnis des dn/dc ist entscheidend bei der Analyse von Polymeren und Biomolekülen mittels Mehrwinkel-Lichtstreuung zur absoluten Charakterisierung der molaren Masse. Der dn/dc-Wert ist für jede Kombination von gelöster Substanz, Lösungsmittel, Wellenlänge und Temperatur einzigartig, sodass es wichtig ist, ihn bei der gleichen Wellenlänge wie das Lichtstreuungsgerät und die Versuchsbedingungen zu messen. Dies ist beim Optilab® von Wyatt der Fall.
Fazit: Welche Vorteile bringt der Einsatz eines Refraktometers?
Die Einsatzmöglichkeiten eines Refraktometers sind vielfältig und hierdurch ergeben sich auch sehr breit gestreute Vorteile des Einsatzes. Es gibt ein großes Spektrum verschiedener Geräte: Handrefraktometer sind eine kostengünstige Möglichkeit zur Probencharakterisierung und oft erhältlich für spezielle Anwendungen (z.B. zur Bestimmung des Wassergehaltes in Betriebsflüssigkeiten oder des Zuckergehaltes bei der Lebensmittelproduktion). Differentielle Refraktometer können chromatographischen Trennverfahren nachgeschaltet werden und erlauben es, in Kombination mit einem Mehrwinkel-Lichtstreudetektor das absolute Molekulargewicht von Makromolekülen zu bestimmen. Diese Geräte sind weitaus komplexer und detektieren schon geringste Veränderungen der Konzentration einer Substanz. Wenn Sie mehr über differentielle Refraktometer und ihren Einsatz in Wissenschaft und Forschung erfahren wollen, wenden Sie sich jederzeit an das Wyatt-Team, um eine maßgeschneiderte Lösung für Sie zu diskutieren.Weitere Fragen und Antworten zu Refraktometer
Was ist ein Refraktometer?
Ein Refraktometer ist ein Messinstrument zur Bestimmung des Brechungsindex von Flüssigkeiten oder Feststoffen. Es nutzt das Verhalten von Licht beim Übergang zwischen einem Prisma mit bekannten Eigenschaften und dem zu prüfenden Stoff.
Wozu dient die Messung mit dem Refraktometer?
Refraktometer dienen der Bestimmung des Brechungsindexes von Flüssigkeiten oder Feststoffen. Aus diesem Wert lassen sich Informationen über Identität, Qualität und Konzentration ableiten. Die Messung ermöglicht ein tieferes Verständnis der Probe.
In welchen Bereichen wird ein Refraktometer angewendet?
Refraktometer werden in verschiedenen Bereichen eingesetzt, z. B. in der Lebensmittelindustrie zur Qualitätsbewertung und Bestimmung des Wassergehalts von Betriebsflüssigkeiten in der Automobilindustrie.
Wie funktioniert ein Refraktometer?
Ein Refraktometer funktioniert durch Durchlichtmessung von Licht, das durch zwei rechtwinklige Prismen aus Glas mit gleichem Brechungsindex geleitet wird. Der Brechungsindex wird bestimmt, indem der kritische Winkel der Totalreflexion gemessen wird.
Welche Vorteile bringt der Einsatz eines Refraktometers?
Refraktometer bieten eine kostengünstige Möglichkeit zur Probencharakterisierung und sind für spezielle Anwendungen erhältlich. Differentielle Refraktometer sind komplexer und ermöglichen die Bestimmung des absoluten Molekulargewichts von Makromolekülen, falls sie mit einem Lichtstreudetektor kombiniert werden.