ASTRA - die wichtigesten Vorteile

Wyatt Technology hat die chromatographische Analyse von Makromolekülen revolutioniert, indem Wyatt die genaue Messung der molaren Masse über Lichtstreuung zur praktischen Realität gemacht hat. ASTRA bringt Ihnen diese Revolution, basierend auf jahrzehntelanger Erfahrung. Erkunden Sie hier einige der Funktionen, die das volle Potenzial der Lichtstreuung ausschöpfen und gleichzeitig die Bedienung erleichtern:

Visuelle Analyse

Die Lichtstreuungs-Analyseansicht in ASTRA bietet die Werkzeuge, um Ihre Daten einfach zu analysieren. Molare Masse und Radius werden sofort berechnet und für jeden Punkt im Chromatogramm angezeigt. Die Punkte können direkt im Chromatogramm ausgewählt werden. Die Winkelabhängigkeit des Lichtstreusignals kann in jedem Punkt bewertet werden. Darüber hinaus können einzelne Detektoren mit sofortiger Rückmeldung aktiviert oder deaktiviert werden.

ASTRA unterstützt mehrere hochentwickelte Modelle zur Analyse der Winkelabhängigkeit der Lichtstreuintensität, um Größeninformationen zu erhalten. Details finden Sie im Abschnitt zur Partikelanalyse.

Unterstützung von Lichtstreudetektoren

Die meisten anderen Softwarepakete, die Lichtstreudaten verarbeiten, bieten keine native Unterstützung von Lichtstreudetektoren. Stattdessen erfordern sie, dass Polymerstandards zur Kalibrierung des Instruments verwendet werden. Damit entfällt der grundlegende Vorteil der Lichtstreuung, die Molare Masse direkt zu messen und wird stattdessen mit allen Schwächen der Säulenkalibrierung behaftet.

ASTRA ist für die Einbettung von Lichtstreuinstrumenten konzipiert. Es werden keine Polymerstandards benötigt, um ein Instrument zu kalibrieren. Stattdessen wird eine einfache Messung der grundlegenden Streuung an einem reinen Lösungsmittel im Detektor selbst verwendet, um alle weiteren Messungen in die nativen Streueinheiten, dem Rayleigh-Verhältnis, umzurechnen. Es sind keine Annahmen notwendig. In Kombination mit einem Konzentrationsdetektor misst ASTRA die molare Masse direkt.

Vorteile der Lichtstreuung

Die Lichtstreuung zeichnet sich durch ihre Fähigkeit aus, die molare Masse von Makromolekülen in Lösung sowohl genau als auch schnell zu messen:

• Im Gegensatz zur Massenspektrometrie kann die Lichtstreuung die molare Masse und den Aggregatzustand bestimmen.
• Im Gegensatz zur analytischen Ultrazentrifugation kann die Lichtstreuung die molare Masse und den Aggregatzustand in Echtzeit für fraktionierte Proben messen.
• Im Gegensatz zur Säulenkalibrierung werden bei der Lichtstreuung keine externen Standards benötigt und es werden keine Annahmen über das Elutionsverhalten der Probe getroffen.

Zusätzlich zur molaren Masse misst die Lichtstreuung auch die Größe. Weitere Informationen über die Funktionsweise der Lichtstreuung finden Sie auf unserer Theorieseite.

Die meisten Chromatographie-Analyseprogramme berechnen die Eigenschaften einer Probe für einen einzelnen Peak, d. h. einen Elutionsbereich. So kann man z. B. die durchschnittliche molare Masse, die intrinsische Viskosität oder den hydrodynamischen Radius für einen Peak bestimmen. Dies ist eine sehr leistungsfähige Methode zur Charakterisierung verschiedener Fraktionen einer eluierenden Probe.

Eine weitere Möglichkeit, Daten aus einer fraktionierten Probe zu interpretieren, ist die Betrachtung von distributions der gemessenen Größen. Zum Beispiel könnte man den Anteil einer Probe ermitteln wollen, der eine molare Masse innerhalb eines bestimmten Bereichs aufweist. Dies lässt sich durch die Berechnung einer kumulativen Verteilung der molaren Massen erreichen.

Um eine kumulative Verteilung zu berechnen, werden die folgenden Schritte durchgeführt:

1. Die Gesamtmasse der eluierenden Probe wird berechnet. Wenn die Konzentration zu jedem Zeitpunkt gemessen wird, dann ist die Gesamtmasse gleich der Summe der Konzentrationsmessungen mal dem Volumen der Elutionsbereiche.
2. Die molare Masse wird zu jedem Zeitpunkt mit einem DAWN- oder miniDAWN-MALS-Detektor berechnet.
3. Die resultierenden molaren Massen und die gemessene Konzentration an diesem Punkt werden dann nach aufsteigender Masse sortiert.
4. Der Gewichtsanteil der Probe mit einer bestimmten oder niedrigeren molaren Masse wird berechnet, indem alle Konzentrationen bis zu der angegebenen molaren Masse summiert werden. Diese Summe wird anschließend mit dem Volumen des Elutionsbereichs multipliziert und durch die Gesamtmasse der Probe dividiert.

Warum die Bandenverbreiterungskorrektur für Verteilungen unerlässlich ist:

Die berechneten Verteilungen stellen ein genaues Abbild der berechneten Werte für jeden Elutionsbereich dar. Wie in der Diskussion über die Bandenverbreiterung gezeigt, kann die Einstellung einer Peakregion die Verzerrung in der Molare Masse über den Peak kompensieren; die durchschnittliche molare Masse ist korrekt. Es gibt jedoch keine Möglichkeit, die Verzerrung in der Verteilungsdarstellung zu kompensieren. Ohne die Korrektur der Bandverbreiterung werden die Werte eines scharfen, monodispersen Peaks künstlich gespreizt. Es entsteht ein scheinbarer Auflösungsverlust. Mit der Korrektur der Bandenverbreiterung wird die wahre Verteilung sichtbar, und die Auflösung wird wiederhergestellt. Die untenstehende Animation von BSA-Oligomeren, die mit und ohne Bandenverbreiterungskorrektur gemessen wurden, zeigt deutlich, dass die Bandenverbreiterungskorrektur notwendig ist, um genaue Verteilungen zu bestimmen.

Die Lichtstreuung kann zur Messung des zweiten Virialkoeffizienten (A₂) eines Makromoleküls verwendet werden. A₂ ist ein Maß für die makromolekulare Wechselwirkung eines Analyten mit sich selbst und ist ein nützlicher Parameter für die Optimierung der Kristallisations- und Formulierungsbedingungen von Proteinen.

Traditionell wurde A₂ in einem mühsamen Prozess gemessen, bei dem mehrere Konzentrationen einer Probe vorbereitet und anschließend mehrere Messungen durchgeführt wurden, um einen klassischen Zimm-Plot zu erstellen. Wyatt Technology hat es sich zur Aufgabe gemacht, diese Technologie in das 21. Jahrhundert zu bringen, zumal sie für Proteinforscher von wachsender Bedeutung ist. Einige der Möglichkeiten, die wir implementiert haben oder derzeit erforschen, sind:

Online-A₂-Bestimmung

ASTRA unterstützt die Analyse von schnellen Injektionen kleiner Probenvolumina, die idealerweise in einem Verdünnungsprozess in einem Autosampler vorbereitet wurden. Diese patentierte Online-Analyse kann A₂ mit einem Bruchteil der für herkömmliche Messungen benötigten Probe ermitteln und unterstützt Automatisierung und High-Throughput-Studien.

Es ist möglich, die molare Masse, die Größe und die relativen Polymeranteile eines Copolymers mit Hilfe der Lichtstreuung zu bestimmen. Dazu werden lediglich zwei zusätzliche Detektoren benötigt, die unterschiedliche Empfindlichkeiten für die einzelnen Polymere aufweisen. Traditionell wird die Lichtstreuung zu diesem Zweck in Verbindung mit einem RI- und UV-Detektor verwendet.

Eine wichtige Klasse von Copolymeren sind Proteinkonjugate. Zum Beispiel ist es häufig relevant, den Proteinanteil in glykosylierten und PEGylierten Proteinen sowie Membranprotein-Detergenz-Komplexen zu bestimmen. ASTRA verfügt über eine integrierte Unterstützung für die Analyse von Proteinkonjugaten und Copolymeren unter Verwendung eines Lichtstreudetektors in Verbindung mit einem UV- und RI-Detektor.

Da bei der Analyse von Proteinkonjugaten drei Detektoren in Reihe geschaltet werden, ist es absolut notwendig, Bandenverbreiterungseffekte zu korrigieren, um genaue Ergebnisse zu erhalten. Siehe hierzu untenstehende Animation der relativen Protein- und Modifikator-Fraktionen für einen Membranprotein-Detergenz-Komplex. Der Proteinanteil und die Masse sollten über den Elutionspeak konstant sein. Ohne die Korrektur der Bandenverbreiterung ist es unmöglich, dies festzustellen. Mit der Korrektur durch die ASTRA Software sind die wahren Fraktionen sofort ersichtlich.

ASTRA verfügt über verschiedene Methoden zur Bestimmung der dn/dc- und UV-Extinktionskoeffizienten Ihrer Probe:

Die MALS-Analyse basiert auf der Intensität des gestreuten Lichts, das von vielen Photodioden auf verschiedenen Winkeln gemessen wird. Wenn die korrekte Masse einer Probe gemessen werden soll, müssen bekannte Schwankungen in der Intensität der Laserquelle berücksichtigt werden, damit solche Änderungen nicht fälschlicherweise der zu analysierenden Probe zugeordnet werden.

ASTRA^® ist in der Lage, Schwankungen der Laserintensität aufgrund von Leistungsschwankungen zu berücksichtigen, indem das gemessene Signal durch den Lasermonitor dividiert wird. ASTRA kann auch Änderungen der gemessenen Intensität aufgrund der Probenabsorption berücksichtigen. Dies wird erreicht, indem eine zusätzliche Korrektur der gemessenen Intensität durchgeführt wird, die auf Änderungen des Vorwärts-Lasermonitorsignals basiert.

Ergebnisse

Die Vorwärtsmonitorkorrektur passt die gemessene Lichtintensität basierend auf der Änderung des Vorwärtsmonitors an, und zwar proportional zur Quadratwurzel des Verhältnisses zwischen dem Vorwärtsmonitorsignal und dem durchschnittlichen Vorwärtsmonitorsignal. Folglich sind bei kleinen Schwankungen des Vorwärtsmonitorsignals auch kleine Änderungen der gemessenen molaren Masse zu erwarten. Die folgenden Beispiele veranschaulichen diese Effekte.

Betrachtet man, wie unten dargestellt, den Vorwärtslasermonitor (gemessen an Aux-Kanal 2) einer Lösung ergibt sich ein Durchschnittswert von ~3,05 V, so fällt dieser in Gegenwart der absorbierenden Probe jedoch auf ~2,35 V ab (ein Abfall von ~23 %). Folglich sollte die erwartete Änderung der molaren Masse ungefähr diesem Wert entsprechen. Ein Vergleich der Probe mit und ohne Vorwärtsmonitorkorrektur ist unten dargestellt.

Bei fast allen Online-Fraktionierungsverfahren werden Detektoren in Reihe geschaltet. Wie in der obigen Animation gezeigt, entsteht dadurch jedoch ein grundlegendes Problem. Wenn sich ein schmaler „Peak“ entlang des Fließwegs bewegt, wirkt jede Durchflusszelle wie ein kleines Mischungsvolumen. Der anfänglich scharfe Peak mit einem leichten exponentiellen Tailing verbreitert sich. Jeder Detektor im Flussweg sieht einen zunehmend breiteren Peak, der sich von dem anfänglichen idealen Peak unterscheidet.

Obwohl diese Verbreiterung geringfügig erscheinen mag, hat sie nachteilige Auswirkungen auf jede Analysemethode, die sich auf Daten von mehreren Detektoren stützt. Siehe hierzu die fraktionierte BSA-Monomerprobe auf der rechten Seite, die von einem Lichtstreuungs- (LS) und einem Brechungsindexdetektor (RI) in Reihe erfasst wurde. Die berechnete molare Masse hängt vom Verhältnis des Lichtstreuungs- und Brechungsindexpeaks ab. Der RI-Peak (gestrichelte Linie) ist im Vergleich zum LS-Peak (durchgezogene Linie) deutlich verbreitert, was zu einer berechneten molaren Masse führt, die eine Verzerrung über dem Peak aufweist. Für BSA-Monomer sollte die Masse jedoch über den Peak hinweg konstant sein.

Wyatt Technology bietet eine echte Lösung für dieses grundlegende Problem. Unsere Wissenschaftler haben einen patentierten Algorithmus zur Korrektur der Bandenverbreiterung entwickelt, der den physikalischen Bandenverbreiterungsmechanismus berücksichtigt und korrigiert.

Es gibt viele Fälle, in denen vorgegebene Änderungen der Flussrate, der Temperatur und andere Effekte dazu führen können, dass die Basislinien des Geräts so driften, dass die standardmäßige lineare Basisliniensubtraktion das Problem nicht korrigieren kann. Es kann ein Satz von Leerwertdaten erfasst werden, der diese Effekte modelliert. Durch Subtrahieren dieses Leerlaufs können wir brauchbare Ergebnisdaten erzeugen.

Im Partikelmodus ist es möglich, die Größe und Anzahl einer Partikelprobe nur mit einem DAWN^® zu messen. ASTRA unterstützt mehrere Modelle zur Bestimmung der Größe eines Makromoleküls auf der Grundlage der Winkelabhängigkeit der Lichtstreuintensität:

• Zimm-, Debye- und Berry-Formalismen: Traditionelle Multipolenentwicklung zur Bestimmung des rms-Radius der Probe unabhängig von der Geometrie.
• Random Coil und Kugel: Definierte mathematische Ausdrücke für Teilchen mit bekannten Geometrien. Anwendbar im Rayleigh-Gans-Debye-Limit, wenn die Brechungsindizes des gelösten Stoffes und des Lösungsmittels ähnlich sind.
• Mie: Mie-Berechnungen zur Bestimmung des geometrischen Radius von kugelförmigen Proben. Anwendbar auf Proben mit beliebigem Brechungsindex.
• Beschichtete Kugel: Ideal für die Modellierung von Lipid-Vesikeln, bei denen die Dicke der Hülle bekannt ist.
• Stäbchen: Wenn der Radius des Stäbchens bekannt ist, kann dieses Modell zur Bestimmung der Länge angewendet werden.

Eine gute Chromatographie zeichnet sich durch eine Basislinientrennung zwischen den möglichst symmetrischen Peaks aus. Aber was ist, wenn wir Tailing und Asymmetrie beobachten? Ist die Chromatographie dann noch „gut genug“? ASTRA kann die Qualität der Chromatographie anhand von Parametern wie Peakhöhe, theoretischen Böden, Peakbreite, Asymmetrie, Tailing und Auflösung beurteilen. Diese Analyse ist in jeder Online-Methode in der Software integriert, so dass keine zusätzliche Chromatographie-Software benötigt wird, um diese Berechnungen durchzuführen. Numerische Vergleiche von Trennungen sind besonders hilfreich für die Entwicklung von Trennmethoden

Visualisieren Sie diese Parameter für jeden Inline-Detektor - MALS, UV oder RI - im anpassbaren ASTRA-Bericht.

Die Software von Wyatt Technology wird von Wissenschaftlern für Wissenschaftler geschrieben. Es ist für uns selbstverständlich, dass Unsicherheiten in berechneten Größen notwendig sind, um jede Messung zu bewerten. Alle berechneten Ergebnisse in ASTRA werden mit statistischen Unsicherheiten dargestellt, die aus einer sorgfältigen Fehleranalyse und Unsicherheitsfortpflanzung resultieren.

Darüber hinaus enthält ASTRA patentierte Algorithmen zur genauen Bestimmung der Unsicherheit in allen gemessenen Größen. Diese Unsicherheiten sind wesentlich für die Verwendung in weiteren Analysen und für die Bewertung des Signal-Rausch-Verhältnisses. Wenn diese Fehleranalyse mit den leistungsstarken Bericht- und Grafikfunktionen von ASTRA kombiniert wird, ist das Ergebnis eine Software, die Forschern die Werkzeuge an die Hand gibt, die sie benötigen, um Ergebnisse in Publikationsqualität zu erzeugen.

Mit der EASI-Graph-Funktion von ASTRA können Sie Chromatogramme und berechneten Ergebnisse, wie z.B. leere und volle Partikelkonzentrationen oder die molare Massen, aus mehreren Läufen überlagern. EASI-Table vergleicht numerische Ergebnisse aus verschiedenen Läufen in einem einfach zu lesenden Format und bietet statistische Analysen.

Lichtstreuung

Wenn ein DAWN oder miniDAWN und ein Konzentrationsdetektor verwendet werden, um molare Massen- und Radiusmessungen durchzuführen, kann ASTRA die Form des Moleküls basierend auf der gemessenen molaren Masse und des rms-Radius beurteilen. Ein Diagramm des logarithmischen rms-Radius als Funktion des logarithmischen Wertes der molaren Masse, ein sogenanntes Konformationsdiagramm, zeigt die Beziehung zwischen den beiden Größen. Die Steigung dieses Diagramms gibt eine gute Abschätzung der Form:

• Kugel: Steigung ist ungefähr 0,33
• Random Coil: Die Steigung beträgt etwa 0,5 - 0,6
• Stäbchen: Steigung ist ungefähr 1,0

Bei Molekülgrößen über 10 nm können wir sowohl die molare Masse als auch den rms-Radius gleichzeitig messen, indem wir lediglich ein Lichtstreuinstrument und eine Konzentrationsquelle verwenden.

Wässriges Polymer

Polyethylen in TCB

Lichtstreuung mit Viskosimetrie

Wenn wir die Konformation von Molekülen mit einem rms-Radius unter 10 nm bestimmen möchten, kann ein ViscoStar zur Bestimmung der Konformation in die Analyse einbezogen werden. Ein Plot des Logarithmus der intrinsischen Viskosität als Funktion der molaren Masse, Mark-Houwink-Sakurada- Plot (MHS-Plot) genannt, zeigt die Beziehung zwischen den beiden Größen. Wie beim Konformationsdiagramm gibt die Steigung dieses Diagramms (der MHS-Term a) einen guten Schätzwert für die Molekülform:

• Kugel: a ist ungefähr 0
• Lineares Random Coil unter Theta-Bedingungen: a ist ungefähr 0,5
• Lineare Polymere in gutem Lösungsmittel: a ist ca. 0,5 bis 0,8
• Starres Stäbchen: a ist ca. 1,8 bis 2,0

Wasserlösliches Polymer

Synthetisches Polymer

Wenn Sie mit einem DAWN oder miniDAWN die molare Masse bestimmen, ist es möglich, Verzweigungsberechnungen durchzuführen, um die Verzweigung einer Polymerprobe zu charakterisieren. ASTRA kann den Grad der tri- oder tetrafunktionalen Verzweigung bestimmen und sogar Stern- und Kamm-Polymere analysieren. Wenn die molare Masse und der rms-Radius für ein lineares und ein entsprechend verzweigtes Polymer gemessen werden, kann ASTRA die folgenden Größen berechnen:

• Verzweigungsverhältnis g_M .
• Verzweigungseinheiten pro Molekül.
• langkettige Verzweigungen.

Wenn das Polymer zu klein (rms-Radius < 10 nm) für Größenmessungen mittels Lichtstreuung ist, kann ASTRA außerdem die „Massenmethode“ für Proben mit bekannten Mark-Houwink-Sakurada Parametern und Elutionszeiten verwenden.

Mit der grafischen Darstellung der Verzweigungsanalyse haben Sie alles zur Hand, um Verzweigungsberechnungen zu vereinfachen. Wählen Sie zwischen vier verschiedenen Polymertypen: tri- oder tetrafunktional, stern- oder kammförmig, geben Sie Parameter für die langkettige Verzweigung oder die Massenmethode ein und erhalten Sie schließlich die Ergebnisse durch simple Auswahl des Diagrammtyps. Bitte beachten Sie den Vergleich der Konformationsdiagramme und Steigungen für eine lineare und eine verzweigte Probe.

Die folgenden Diagramme zeigen die anderen Visualisierungen, die in der grafischen Darstellung der Verzweigungsanalyse verfügbar sind:

ASTRA bietet eine integrierte Unterstützung für die Erfassung und Analyse von Viskosimetriedaten mit Hilfe des
ViscoStar^®. Das Viskosimetriemodul kann auch für Hochtemperatur-GPC-Anwendungen verwendet werden. Es werden mehrere verschiedene Arten der Viskositätsanalyse durchgeführt. In Verbindung mit der Erfahrung von Wyatt Technology bezüglich der Bestimmung der molaren Masse mittels Lichtstreuung hat die makromolekulare Charakterisierung mittels Viskosimetrie mit ASTRA ein neues Niveau erreicht.

Intrinsische Viskositätsberechnungen

Mit dem ViscoStar und einem Konzentrationsdetektor in Reihe ist es möglich, die intrinsische Viskosität einer Probe als Funktion des Elutionsvolumens zu berechnen. Legen Sie einen Peakbereich fest und geben Sie einen dn/dc oder UV-Extinktionswert für die Probe ein, wenn Sie einen RI- bzw. UV-Konzentrationsdetektor verwenden. Vor allem aber ermöglicht die leistungsstarke Bandverbreiterungskorrektur von ASTRA zum ersten Mal eine genaue Analyse von Viskosimetriedaten. Siehe hierzu die intrinsische Viskosität für eine BSA-Oligomerprobe mit und ohne die Bandenverbreiterungskorrektur. Der Wert für die intrinsische Viskosität eines jeden Oligomers kann mit ASTRA präzise und robust bestimmt und ausgegeben werden.

Molare Masse: Mark-Houwink-Sakurada-Verfahren

ASTRA kann Daten des ViscoStar und eines Konzentrationsdetektors verwenden, um die molare Masse auf der Grundlage der Mark-Houwink-Sakurada-Gleichung (MHS) zu berechnen. Um dieses Verfahren zu verwenden, müssen lediglich die Mark-Houwink K und a Koeffizienten bekannt sein. Diese können aus der Literatur entnommen oder mit unübertroffener Genauigkeit mit Hilfe von ASTRA in Kombination mit einem Lichtstreudetektor, ViscoStar und einem Konzentrationsdetektor bestimmt werden. Sobald die molare Masse berechnet wurde, werden die leistungsstarken Verteilungs- und Momentanalysen von ASTRA verwendet, um die molaren Massenmomente (M_n, M_w, und M_z) und die molaren Massenverteilungen für Ihre Probe zu berechnen. Vor allem aber profitiert die MHS-Prozedur von ASTRAs Bandenverbreiterungskorrekturen, die es ermöglichen, die molare Masse für jedes Elutionsvolumen genau zu bestimmen.

Molare Masse: Universelle Kalibrierung

Die universelle Kalibrierung erstellt eine Kalibrierkurve für eine bestimmte Säule, wobei nur das ViscoStar und ein Konzentrationsdetektor (Optilab oder UV) verwendet werden. Die Elutionszeit steht in direkter Beziehung zum hydrodynamischen Volumen, das wiederum mit der molaren Masse und der intrinsischen Viskosität zusammenhängt. Unter der Annahme, dass es sich bei der Probe um ein Random-Coil-Polymer handelt, werden die intrinsische Viskosität und die Elutionszeit kombiniert, um die molare Masse zu bestimmen. Die Ergebnisse der universellen Kalibrierung können in Verteilungen und Momente umgewandelt werden, genau wie die Ergebnisse des MHS-Verfahrens.

Warum die Bandverbreiterungskorrektur für die Viskosimetrie unerlässlich ist

Viskosimeter haben neben Vermischungseffekten eine zusätzliche Quelle für die Bandenverbreiterung (siehe Bandverbreiterungskorrektur für weitere Details). Wenn eine Probe in die zweite Stufe der Kapillarbrücke eintritt, erzeugt sie einen Differenzdruck, der sich als Viskosimeteriesignal zeigt. Das Volumen eines Arms der Brücke beträgt etwa 30 µL. Da der Probenfluss in der Brücke aufgeteilt wird, beträgt das detektierte Elutionsvolumen bei einem Viskosimeter also etwa 60 µL. Im Vergleich dazu beträgt das Detektionsvolumen eines Lichtstreu- oder Konzentrationsdetektors < 1 µL.

Ein anfänglich scharfer Peak wird also allein für das Viskosimeter um ca. 60 µL verbreitert, ohne die Bandenverbreiterung durch die Vermischungseffekte zu berücksichtigen. Dies macht die Korrektur der Bandenverbreiterung für die genaue Bestimmung der intrinsischen Viskosität unerlässlich, da die intrinsische Viskosität aus dem Verhältnis der Peaks von Viskosimeter und Konzentration berechnet wird.

Die leistungsstarke Bandverbreiterungskorrektur von ASTRA berücksichtigt sowohl die Art der Bandenverbreiterung, die in Viskosimetern vorhanden ist, als auch die Bandenverbreiterung aufgrund von Vermischungseffekten. Zum ersten Mal können genaue intrinsische Viskositäten für schmale Standards gemessen werden.

ASTRA unterstützt konventionelle und universelle Kalibrierung und ermöglicht es den Anwendern, eine Brücke zwischen ihren alten Datenarchiven (konventionelle und universelle Kalibrierung) und der modernen, genauen Massenbestimmung durch Mehrwinkel-Lichtstreuung zu schlagen.

Das Kalibrierungsmodul bietet die Möglichkeit, Daten aus mehreren Kalibrierstandardläufen zusammenzuführen, um ein Säulenprofil über den gesamten Trennbereich der Säule zu bestimmen. Ein typischer Arbeitsablauf beinhaltet die Erfassung von Daten aus mehreren Probenläufen (Abbildung 1), die dann kombiniert werden (Abbildung 2), um die endgültige Kalibrierkurve zu bilden.

Die Kalibrierungsdaten aus mehreren Läufen können zusammengeführt werden, um eine vollständige konventionelle Kalibrierungskurve unter Verwendung des Signals eines Konzentrationsdetektors typischerweise Differentialrefraktometer oder eine universelle Kalibrierkurve unter Verwendung des Signals eines Konzentrationsdetektors mit Mark-Houwink-Sakurada-Koeffizienten oder kombinierten Signalen von Konzentrationsdetektoren und Viskosimeter zu bilden.

Das fertige Kalibrierungsprofil kann dann verwendet werden, um mittlere molare Masse und molare Massenverteilung einer unbekannten Probe zu analysieren. Die Kalibrierungsergebnisse sind im Säulenprofil zusammen mit diagnostischen Informationen über die Säule, wie z.B. Anzahl der theoretischen Böden, Asymmetriefaktor, Auflösung usw. dargestellt (siehe Abbildung 5). Diese Felder können verwendet werden, um die Leistungsänderung der Säule im Laufe der Zeit zu verfolgen.

Der Vergleich der absoluten molaren Masse, die von MALS abgeleitet werden, und der relativen molaren Masse, die von den Kalibrierungsergebnissen abgeleitet werden, kann verwendet werden, um ein Archiv von Vergleichsdaten aufzubauen, das die absolute auf die relative molare Masse abbildet. Der Vergleich von molarer Massen, die durch konventionelle Kalibrierung erhalten werden, mit der aus MALS-Kalibrierung bestimmten molaren Masse kann nicht nur mögliche Fehler veranschaulichen, die durch konventionelle Größenausschlusschromatographie erzeugt werden, sondern kann auch für die Charakterisierung von Verzweigungen nützlich sein.

ASTRA unterstützt die Datenerfassung und -analyse mittels WyattQELS DLS-Modul und ausgewählter DynaPro-Geräte. Bei der Analyse von DLS-Daten kann ASTRA:

• Die translationale Diffusion und den entsprechenden hydrodynamischen Radius jeder eluierenden Fraktion in einer Online-Messung messen.
• Integrale und differentielle Verteilungen der translationalen Diffusionskoeffizienten und hydrodynamischen Radien bestimmen.
• Das Verhältnis von hydrodynamischem Radius (R_h) und rms-Radius für zusätzliche Konformationsinformationen berechnen.
• Die vollständige Korrelationsfunktion zur Überprüfung und Analyse darstellen.
• Unsicherheiten der gemessenen Größen berechnen.

Es können benutzerdefinierte Diagramme erstellt werden, die nicht nur den R_h-Wert als Funktion des Elutionsvolumens, sondern auch die Unsicherheiten in den dargestellten Größen zeigen. Verdeutlicht wird das im Diagramm von R_h gegen Elutionsvolumen für eine fraktionierte BSA-Probe.

Im Gegensatz zur Online-DLS-Analyse wird bei Batch-DLS-Messungen das WyattQELS-Modul zur Charakterisierung von unfraktionierten Proben verwendet. Batch-DLS-Analyseverfahren können Informationen über die Größenverteilung in einer Probe liefern.

Regularisierungsanalyse

ASTRA verwendet den hochentwickelten DYNALS-Regularisierungsalgorithmus von ALANGO. DYNALS bietet adaptive Eigenschaften zusammen mit einer sehr schnellen Datenverarbeitung. Das DYNALS-Regularisierungsschema kann verwendet werden, um semiquantitative Verteilungen für breit polydisperse, d.h. über mehrere Größenordnungen verteilte, Proben zu bestimmen und sogar zwei verschiedene Spezies in einer unfraktionierten Probe zu ermitteln, wenn der Größenunterschied mindestens einen Faktor von drei beträgt und findet immer zwei Spezies, wenn der Größenunterschied größer als ein Faktor von fünf ist.

Kumulantenanalyse

Eine alternative Analysetechnik zur Charakterisierung von DLS-Ergebnissen mittels Verteilungsfunktionen, definiert durch den mittleren Radius und der Breite (Polydispersität), die die Homogenität der Population beschreibt. Dieses Verfahren wird als Kumulantenanalyse bezeichnet. Diese Ergebnisse werden in Echtzeit, in numerischer und grafischer Form dargestellt.

Funktionen:

• Mittelwertbildung von Korrelationsfunktionen über Bereiche zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses.
• Vorfilterung von Korrelationsfunktionen basierend auf einer einfachen exponentiellen Funktion.
• Grafische Darstellung des Ergebnisses der Korrelationsfunktion und der zugehörigen Fehler.
• Grafische Darstellung der Standardabweichung sowie Mittelwert und Größenbereiche für jede Akquisition.
• Vollständig “21 CFR Part 11”-konform mit ASTRA Security Pack-Version.

“21 CFR Part 11” verlangt, dass elektronische Daten beständig sind und dass alle Änderungen an den Daten in einem Audit Trail aufgezeichnet werden. ASTRA und DYNAMICS verwenden drei Methoden, um dies zu gewährleisten:

• Alle von ASTRA und DYNAMICS im Security-Pack-Modus erzeugten Daten und Audit-Trails werden in einer sicheren, ODBC-kompatiblen Datenbank gespeichert. Die Datenbank kann zur automatischen Datensicherung durch die IT-Abteilung vernetzt werden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Daten nicht verloren gehen und dass alle Änderungen an den Daten mit einem Audit-Trail in derselben Datenbank verknüpft werden.


• Verschlüsselte Prüfsummen: Jeder Eintrag in der Datenbank hat eine verschlüsselte Prüfsumme. ASTRA und DYNAMICS verwenden diese Prüfsumme, um zu verifizieren, dass die Daten, die aus der Datenbank gelesen werden, seit dem letzten Schreiben nicht verändert wurden und um den Benutzer über jede Datenbeschädigung oder jeden Versuch, die Daten zu ändern, zu informieren.


• Ergebnisvergleich (nur in ASTRA): ASTRA speichert berechnete Ergebnisse in der Datenbank. Jedes Mal, wenn die Daten erneut durch ASTRA verarbeitet werden, werden die Ergebnisse mit der historischen Version in der Datenbank verglichen. Wenn sich die Ergebnisse ändern, benachrichtigt ASTRA den Benutzer, so dass entsprechende Maßnahmen ergriffen werden können. Diese Funktion kann bei der Validierung von Software-Updates oder neuen Installationen äußerst hilfreich sein.

Validierung

Eingehende Qualifizierungs- und Betriebsqualifizierungsdokumente werden mit den ASTRA- und DYNAMICS-Sicherheitspaketen bereitgestellt, um die Validierung am Laborstandort sicherzustellen.

Darüber hinaus sind sowohl ASTRA als auch DYNAMICS vollständig validierte Produkte:

• Die gesamte Softwareentwicklung erfolgt unter einem formellen Qualitätssystem, das ein standardisiertes Software-Lebenszyklusmodell verwendet.
• Dokumentierte Tests und Rückverfolgung werden durchgeführt, um die Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Konsistenz der Funktionen zu demonstrieren.
• Die Fähigkeit, geänderte oder ungültige Datensätze zu erkennen, ist eingebaut.

Wir begrüßen Audits des Softwareentwicklungs- und Wartungsprozesses durch qualifizierte Auditoren unserer Kunden.

In einer vorschriftsmäßigen Installation ist der Systemzugang auf autorisierte Personen beschränkt. Die Wyatt-Software nutzt das Sicherheitssystem von Microsoft Windows, um eine Benutzerauthentifizierung zu ermöglichen:

• Sichere Anmeldung - Um ASTRA oder DYNAMICS mit aktiviertem Sicherheitspaket auszuführen, müssen Benutzer eine eindeutige Benutzer-ID und ein Passwort eingeben. Anmeldungen, Anmeldeversuche und Abmeldungen werden im System-Audit-Trail aufgezeichnet.


• Microsoft Windows-Benutzerkonten und -Gruppen werden für die Sicherheit genutzt. Systemadministratoren erstellen vier spezifische Sicherheitsgruppen und ordnen dann vorhandene Microsoft Windows-Benutzer diesen Gruppen zu. Die Microsoft Windows-Benutzerkonten werden dann für die Anmeldung verwendet.


• Es ist möglich, die Sicherheitsgruppen ASTRA oder DYNAMICS im Active Directory einzurichten, so dass netzwerkauthentifizierte Konten mit entsprechenden Berechtigungen ausgestattet werden können. Ein Benutzerkonto auf Domänenebene kann dann verwendet werden, um sich an jeder Instanz von ASTRA oder DYNAMICS im Netzwerk anzumelden.

Berechtigungsstufen

Benutzerkonten können eine von vier Berechtigungsstufen haben:

1. Administrator - Administratoren haben das Recht, alle Aktionen durchzuführen, einschließlich des Änderns von Datenbankverbindungen und des Löschens von Daten.


2. Forscher - Forscher können neue Methoden erstellen und ausführen, Gerätekonfigurationseinstellungen ändern und Daten aus der Datenbank exportieren und importieren.


3. Techniker - Techniker können nur vordefinierte Methoden ausführen, die von einem Forscher eingerichtet wurden. Techniker können Daten sammeln und einfache Verarbeitungen durchführen, aber keine Konfigurationseinstellungen ändern.


4. Gast - Gäste haben nur Leserechte, um Audit-Protokolle und Daten anzuzeigen.

ASTRA und DYNAMICS bieten zwei Ebenen von Prüfprotokollen zur unabhängigen Aufzeichnung aller Bedieneraktionen, die elektronische Datensätze erstellen, ändern oder löschen. Jeder Eintrag im Audit Trail wird mit einem Zeitstempel versehen und zeichnet den Benutzer auf, der die Aktionen durchführt, sowie den Computer, auf dem die Aktionen ausgeführt werden. Im Screenshot rechts wird die allgemeine Ansicht des Systemprotokolls zusammen mit einem Experimentprotokoll angezeigt.

Systemprotokoll

Das Systemprotokoll ist immer mit der Datenbank verbunden, in der die Daten gespeichert sind. Dieses Prüfprotokoll kann nicht von den damit verbundenen Daten getrennt werden. Das Systemprotokoll zeichnet Aktionen auf, wie z. B.:

• Anmeldungen, Anmeldeversuche und Abmeldungen
• Erstellung, Änderung und Löschung von Daten
• Datenbankverbindungen und -trennungen
• Import und Export von Daten aus der Datenbank

Experimentprotokoll

Jedes Experiment verfügt über ein separates Protokoll, das alle Aktionen innerhalb des Experiments aufzeichnet, die sich auf die Daten auswirken. Das Experimentprotokoll ist immer mit dem Experiment verbunden und kann nicht zurückgesetzt werden. Das Experimentprotokoll zeichnet Aktionen auf wie:

• Änderungen der Gerätekonfigurationseinstellungen
• Veränderte Analysemethoden
• Aufzeichnung von Messdaten
• Elektronische Signaturen in Bezug auf ein Experiment
• Änderungen an Darstellungsmethoden

Elektronische Signaturen können für alle in ASTRA oder DYNAMICS erfassten Daten im Security Pack-Modus ausgeführt werden. Um eine elektronische Signatur durchzuführen, gibt der Benutzer zunächst eine Signaturkategorie (z. B. Verantwortung, Genehmigung oder Überprüfung) und eine Beschreibung an und gibt dann eine eindeutige Benutzer-ID und ein Passwort ein. Die elektronische Signatur wird in dem mit den Daten verknüpften Versuchsprotokoll ausgeführt und wird in dem verknüpften Bericht angezeigt.

Es können mehrere elektronische Unterschriften für ein Experiment geleistet werden. In den Ergebnissen kennzeichnet die Software alle elektronischen Signaturen, die vor der letzten Änderung durchgeführt wurden. Wenn die Datei während des Signierens gesperrt ist, sind weitere Änderungen in ASTRA untersagt. Fehlgeschlagene elektronische Signaturversuche werden im Systemprotokoll mit einem Alarmstatus zur sofortigen Benachrichtigung der Systemadministratoren aufgezeichnet.

Idealerweise sollte eine “21 CFR Part 11”2-konforme Anwendung für die Qualitätssicherung in einem Fertigungsprozess nutzbar sein. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es notwendig, dass die Anwendung betriebliche Systemprüfungen zur Durchführung der erlaubten Abfolge von Schritten und Ereignissen unterstützt. Mit anderen Worten, es sollte für einen Techniker in der Qualitätssicherung möglich sein, die Anwendung mit minimalen Eingaben und begrenzten Möglichkeiten, die Ergebnisse durch falsche Entscheidungen zu beeinflussen, auszuführen.

ASTRA SP bietet eine Unterstützung für die Durchführung erlaubter Abfolgen durch die Methoden. Ein Benutzer mit der Berechtigungsstufe „Forscher“ kann ein neues Experiment erstellen und es dann als Methode speichern. Ein Benutzer mit der Berechtigungsstufe „Techniker“ kann die Methode nur zum Sammeln und Analysieren von Daten verwenden und kann keine Änderungen an der Methodenkonfiguration, der Analyse oder dem Ergebnisbericht vornehmen.

Mit der Methodentechnologie unterstützen ASTRA und DYNAMICS die Charakterisierung von Makromolekülen und Nanopartikeln in alltäglichen Fertigungs- und Qualitätssicherungsanwendungen.

Alle Daten, die ASTRA und DYNAMICS generieren, werden dem Benutzer in menschenlesbarer Form zur Verfügung gestellt. Mit Hilfe leistungsstarker Datenexport- und Präsentationsfunktionen können alle Daten grafisch dargestellt, in Tabellen angezeigt oder als Text exportiert werden. Darüber hinaus sind ASTRA-Berichte anpassbar, um die relevanten Daten zu präsentieren, und können in das PDF-oder HTML-Format exportiert werden.