Lichtstreuung im Chromatographie Modus

In einem Chromatographie-Lichtstreuungsexperiment wird der Mehrwinkel-Lichtstreudetektor (MALS), wie beispielsweise DAWN^® oder miniDAWN^®, mit einer Trennsystem gekoppelt, die die Probe auf der Grundlage ihrer physikalischen Eigenschaften trennt. Die häufigste Trennmethodemethode, die zusammen mit MALS verwendet wird, ist die HPLC-Größenausschlusschromatographie (HP-SEC). HP-SEC-MALS liefert die genaue Bestimmung von molaren Massen- (M_w) und Größen-Verteilungen (root mean square radius, R_g) im Gegensatz zu:

• Standard-SEC, die von der Säulenkalibrierung mit Referenzstandards abhängt.
• Batch-MALS (in Küvette), bei dem die gemessenen Werte über alle in der Probe vorhandenen molaren Massen und Größen gemittelt werden.

Diese Art der Messung hat viele Vorteile gegenüber traditionellen Säulenkalibriermethoden. Da die Intensität der Lichtstreuung und die Konzentration für jede eluierende Fraktion gemessen wird, können die molare Masse und Größe unabhängig vom Elutionsvolumen bestimmt werden. Dies ist besonders wichtig für Proben deren Konformation und/oder chemische Zusammensetzung sich von den Standards unterscheidet oder Proben die mit der Säule interagieren. Diese Proben eluieren nicht wie durch die Säulenkalibrierung beschrieben.

Für die Lichtstreuung im Chromatographie-Modus ist die nicht-ideale Säulenwechselwirkung jedoch kein Problem, da die absolute molare Masse und der Radius für jede eluierende Fraktion gemessen werden. Für MALS Messungen keine Kalibrierstandards notwendig. Daher kann MALS auch die molare Massen- und Radien-Verteilungen gekoppelt an Ionenaustausch- oder Reversed-Phase-Chromatographie messen. Dies ist insbesondere interessant, da es keine Möglichkeit gibt, diese Techniken mit herkömmlichen Standards zu kalibrieren.

Eine weitere leistungsstarke Trenntechnik, die oft in Verbindung mit MALS eingesetzt wird, ist die Feldflussfraktionierung (FFF), die Trennungen über einen sehr großen dynamischen Bereich ermöglicht. FFF arbeitet anstelle einer Säule mit einem Trennkanals. Die Eclipse^™ erlaubt somit vielseitige und robuste Fraktionierungen. FFF-MALS kann eingesetzt werden, um gelöste Stoffe und Suspensionen zu charakterisieren, d. h. von kleinen Makromolekülen bis hin zu Nanopartikeln im Mikrometerbereich.

Bei einer typischen SEC-MALS- oder AF4-MALS-Messung wird der Lichtstreudetektor zusammen mit einem Konzentrationsdetektor in Reihe geschaltet. Der Konzentrationsdetektor ist in der Regel ein Differentialrefraktometer (dRI) wie z. B. ein Optilab^® oder ein UV/Vis-Detektor.

Zusätzlich zu der Messung von molarer Massen und Radien mittels MALS, kann die Bestimmung der hydrodynamischen Radien R_h erforderlich sein. Dies wird durch das Hinzufügen eines DLS-Detektionsmodul (Dynamic Light Scattering) ermöglicht, wie z.B. einer WyattQELS oder eines DynaPro^® NanoStar^®. SEC-DLS- und FFF-DLS-Messungen ermöglichen Messungen des hydrodynamischen Radius R_h von < 1 nm bis zu > 250 nm.

Alternativ kann ein Differentialviskosimeter wie der ViscoStar^® in Reihe mit den MALS- und dRI-Detektoren eingesetzt werden, um die intrinsische Viskosität zu bestimmen, die ebenfalls mit R_h in Beziehung steht. Das Verhältnis zwischen molarer Masse und Größe, wie es durch DLS oder Viskosimetrie bestimmt wird, ist ein Indikator für die Molekülkonformation.