Verbessern Sie Ihre Proteinanalytik durch den Einsatz von Streulichtdetektoren

Presented by: Felix Deluweit, Ph.D., Application Scientist, Wyatt Technology Europe GmbH
Presented Live: November 11, 2016
Language: German

Die Größenausschlusschromatographie (engl. Size Exclusion Chromatography, SEC) stellt eine weit verbreitete Technik zur Trennung von Proteinen, Polymeren und Biopolymeren dar. Sie wird häufig mithilfe der konventionellen Säulenkalibrierung auch zur Bestimmung von Molekulargewichten (Mw) eingesetzt. Diese Methode basiert jedoch auf der Verwendung von Standards. Da die SEC aber nach hydrodynamischem Volumen trennt und damit eben nicht exakt nach Molekulargewicht, führen Unterschiede zwischen Probe und Standard – etwa in der Konformation – schnell zu erheblichen Abweichungen der erzielten Ergebnisse von den tatsächlichen Werten.

Im Gegensatz dazu ermöglicht die Mehrwinkellichtstreuung (engl. Multi-Angle Light Scattering, MALS) die Bestimmung der absoluten Molmassen ohne den Einsatz von Standards. Grundlage des Verfahrens ist die Messung der Intensität des von den Molekülen bzw. Partikeln gestreuten Lichts.

Neben der statischen Lichtstreuung (SLS), wie sie bei MALS Anwendung findet, ist die dynamische Lichtstreuung (DLS) eine schnelle Methode zur Qualifizierung verschiedener Pufferbedingungen und zur Identifizierung von Aggregaten. Über ihren Einsatz in Formulierungsstudien hinaus stellt die dynamische Lichtstreuung überdies eine sensitive und zuverlässige Technik dar, um die Stabilität von Proteinen zu untersuchen. Sie bietet damit eine Alternative zu Farbstoff - basierten Methoden. Während die DLS eher als Batch-Technik (Küvette oder Mikrotiterplatte) Verwendung findet, wird MALS in der Regel mit leistungsfähigen Trennmethoden wie der SEC oder der Asymmetrischen Fluss Feld-Fluss- Fraktionierung (AF4) kombiniert. Mit einer solchen Kopplung lassen sich Molmassenverteilungen von Biomolekülen in Lösung standardfrei untersuchen.

Für die Berechnung der Molekulargewichte mithilfe von MALS benötigt man zusätzlich die Daten aus einem Konzentrationsdetektor (UV- oder RI-Messung). Setzt man beide Verfahren zur Bestimmung der Konzentration ein, so lassen sich auch Copolymer- bzw. Protein- Konjugat - Analysen durchführen. Auf diese Weise kann man zum Beispiel für einen Komplex aus Antikörper und Wirkstoff (ADC: antibody drug complex) das numerische Verhältnis zwischen einem Antikörpermolekül und daran gekoppelten Wirkstoffmolekülen, die so genannte DAR (drug-to-antibody ratio), ermitteln. Diese ist ein wertvoller Indikator zur Beurteilung der Kopplungseffektivität bei der Herstellung solcher Therapeutika.